Badanie aktywności enzymatycznej białka – lucyferazy - jako wskaźnika kinetyki degradacji eukariotycznych mRNA- faza przygotowawcza

Reporter genes are research tools widely used in modern biochemistry. One of them is the gene encoding luciferase. Luciferase is a photoprotein that in the presence of suitable substrates catalyzes the reaction accompanied by emission of light. The use of luciferase for mRNA stability studies is based on joining the luciferase coding sequence with regulatory regions, e.g. 3'UTR (3'-untranslated region), from the mRNA under study. The chimeric transcript constructed in this way is regulated like the tested mRNA, and the luciferase activity is directly proportional to its amount.The aim of the project was to optimize the system for analysis of transcript half-life based on measuring the luciferase enzyme activity. The system takes advantage of the Tet-off system, which allows for switching off luciferase expression by addition of doxycycline. This work presents the initial phase of the project implementation. The first step was to modify the pSBtet-GP vector in such a way that it was possible to clone the 3'UTR region under study behind the luciferase coding sequence. As a result of the modification, the gene encoding luciferase present in the pSBtet-GP vector was replaced with the gene encoding luciferase present in the pmirGLO vector. The second planned stage is the replacement of the gene encoding rtTA protein (component of the Tet-On system) present in the pSBtet-GP vector with the gene encoding tTA protein, which is a component of the Tet-Off system. Then, proper tests are planned consisting of measuring luciferase activity, kinetics of its disappearance after adding doxycycline and checking the correlation of the amount of luciferase, expressed as its activity, with the amount of transcript coding it.

Geny reporterowe są szeroko stosowanym we współczesnej biochemii narzędziem badawczym. Jednym z nich jest gen kodujący lucyferazę. Lucyferaza to białko, które w obecności odpowiednich substratów katalizuje reakcję, której towarzyszy emisja światła. Wykorzystanie lucyferazy do badań stabilności mRNA opiera się na do łączeniu do sekwencji kodującej lucyferazę rejonów regulatorowych z badanego mRNA, np. rejonu 3’UTR (ang. 3’untranslated region). Skonstruowany w ten sposób chimeryczny transkrypt podlega regulacji jak badany mRNA, a aktywność lucyferazy jest wprost proporcjonalna do jego ilości. Celem projektu była optymalizacja systemu do badania czasu półtrwania transkryptów opartego o pomiar aktywności enzymatycznej lucyferazy z wykorzystaniem systemu Tet-off, pozwalającego na wyłączenie ekspresji lucyferazy wskutek dodania doksycykliny. W pracy przedstawiona jest faza wstępna wykonania projektu. Pierwszym etapem była modyfikacja wektora pSBtet-GP w taki sposób, aby możliwe było wklonowanie badanego regionu 3’UTR za sekwencją kodującą lucyferazę. W wyniku modyfikacji zastąpiono gen kodujący lucyferazę obecny w wektorze pSBtet-GP genem kodującym lucyferazę występującym w wektorze pmirGLO. Drugim planowanym etapem jest wymiana genu kodującego białko rtTA (komponent systemu Tet-On) występującego w wektorze pSBtet-GP na gen kodujący białko tTA, będące komponentem systemu Tet-Off. Następnie planowane są właściwe testy polegające na pomiarach aktywności lucyferazy, kinetyki jej zaniku po dodaniu doksycykliny oraz sprawdzenia korelacji ilości lucyferazy wyrażonej przez jej aktywność z ilością kodującego ją transkryptu.