A study of the effect of extracellular vesicles derived from induced pluripotent stem cells cultured in different oxygen conditions on cardiac endothelial cells in the context of myocardial regeneration

Cardiovascular diseases are one of the major causes of death nowadays. The regeneration process focuses on restoring the functionality of heart-building cells, i.e. cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. It includes processes such as: leakage of immune system cells (neutrophils, monocytes), activation of fibroblasts and endothelial cells, their apoptosis and, as a consequence, the formation of scar tissue. An important aspect is also angiogenesis – the process of formation new blood vessels. Scar tissue is a cell free structure, and therefore cannot perform one of the most essential functions, which is contractility. One of potential therapies in regeneration of the heart, is to use stem cells or their extracellular vesicles (EVs). EVs are structures released by the majority of cells and are carriers of bioactive molecules involved in a number of metabolic processes. The use of extracellular vesicles derived from induced pluripotent stem cells seems to be a promising regenerative approach. However, the regenerative potential of EVs derived from physiological hypoxia has not yet been studied, which was the goal of this project. The biological material were human cardiovascular endothelial cells. Cells were subjected to hypoxic conditions at 1% O2 for 2 hours. Then, reoxygenation was carried out by increasing the level of oxygen up to 21%. Then EVs were added from 2 different iPS cell lines cultured in various oxygen conditions - 21%, 5% or 3% O2. Endothelial cells not subjected to hypoxia and reoxygenation and unstimulated EVs constituted a control group. Changes in the level of gene expression were studied by using quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) and the ∆∆CT calculation method. The genes that have been tested are associated with: angiogenesis (FLK1, vWF, VE-CADHERIN), cellular stress (IL-6, IL-1β) and regulation of apoptosis (BAX, BCL2). Results have shown the influence of hiPS-EVs on the expression levels of these genes. The addition of EVs in most cases induced an increase in the level of a gene expression. The strongest stimulation of gene expression was found for EVs derived from hiPS-2 line cultured in 3% hypoxia. This is an important fact in the context of a potential form of myocardial regenerative therapy.

Choroby układu krążenia są jedną z głównych przyczyn zgonów w obecnych czasach. Sam proces regeneracji skupia się na przywróceniu funkcjonalności komórek budujących serce tj. kardiomiocytów, komórkek endotelialnych i fibroblastów. Obejmuje on takie procesy jak: wyciek komórek układu immunologicznego (neutrofile, monocyty), aktywację fibroblastów i komórek śródbłonka, ich apoptozę, a w konsekwencji powstanie tkanki bliznowatej. Ważnym aspektem jest również angiogeneza, czyli proces powstania nowych naczyń krwionośnych. Tkanka bliznowata jest pozbawiona komórek, w związku z czym nie może pełnić istotnej funkcji, jaką jest kurczliwość. Jednymi z potencjalnych terapii w regeneracji serca jest wykorzystanie komórek macierzystych lub pochodzących z nich pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Są to struktury uwalniane zasadniczo przez wszystkie komórki, które są nośnikami bioaktywnych cząsteczek, biorących udział w szeregu procesów metabolicznych. Wykorzystanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych wydaje się obiecującym podejściem regeneracyjnym. Jednak dotychczas nie zbadano jaki jest potencjał regeneracyjny EVs pochodzących z warunków fizjologicznej hipoksji, co było celem niniejszej pracy. Materiałem biologicznym były ludzkie sercowo–naczyniowe komórki śródbłonka. Komórki wprowadzono w stan hipoksji 1% przez 2 godz. Następnie przeprowadzono reoksygenację zwiększając poziom tlenu do 21% i dodano mikropęcherzyki pochodzące z 2 różnych linii komórek iPS hodowanych w 21%, 5% lub 3% stężeniu tlenu. Komórki endotelialne nie poddane hipoksji i reoksygenacji i niestymulowane EVs stanowiły kontrolę. Badano zmiany poziomu ekspresji genów poprzez zastosowanie ilościowej łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) oraz metody obliczeniowej ∆∆CT. Badano geny związane z: angiogenezą (FLK1, vWF, VE-CADHERIN), stresem komórkowym (IL-6, IL-1β) oraz regulacją apoptozy (BAX, BCL2). Wyniki potwierdzają wpływ hiPS-EVs na ekspresję badanych genów oraz procesów z nimi związanych. Dodanie EVs w większości przypadków spowodowało wzrost poziomu ekspresji genów. Najsilniejszą stymulację ekspresji genów stwierdzono w przypadku EVs pochodzących z linii hiPS-2 hodowanych w 3% hipoksji. Stanowi to istotny fakt w kontekście potencjalnej formy terapii regeneracyjnej mięśnia sercowego.