Identification of endothelial subsets involved in interactions with hematopoietic stem cells in bone marrow niche based on single cell RNA sequencing

In the body, all blood cells derive from a rare population of hematopoietic stem cells (HSCs). An important role in maintaining and regulating the activity of HSC is performed by the hematopoietic niche, a specialized, heterogeneous group of cells that create their microenvironment in the bone marrow. Despite extensive research and analysis, there is no agreement regarding the specific components and localization of the niche. Most contemporary works support existence of perivascular niche, however they disagree over the specific type of vessel in proximity of which it is supposed to be located. Therefore, the purpose of the work was to identify the subpopulation of endothelial cells (ECs) participating in the hematopoietic niche.We assumed that the ECs fraction building the hematopoietic niche maintains molecular interactions with hematopoietic stem cells (HSC) and multipotent progenitor cells (MPP) and that these interactions can be predicted based on single cells RNA sequencing. We used ECs data obtained by three independent research teams.Cells suspected of interacting with types of hematopoietic cells have been selected based on the number of individual molecular interactions between these cells. Information on molecular interactions was obtained from a curated database of interactions between membrane receptors and membrane, secretory and extracellular matrix (ECM) ligands. Expression of ligands in single cells was defined by fuzzy logic values. These values were obtained by transforming expression data using logistic function, with parameters specific for each gene.In the combined data, the cells were divided according to the established endothelial subpopulations and new, previously not defined subset has been found. Interactions analysis for all types of ligands, identified newly found subset, as cells with strongest interactions with HSC and MPP cells. Analysis based only on membrane ligands showed interactions of comparable strength for arteriolar and sinusoidal cells. The results cannot conclusively support either arteriolar or sinusoidal niche, suggesting existence of niche based on the new ECs subpopulation. There is also no proof for existence of separate niche for HSC. To facilitate the identification of this new ECs group using cytometry and microscopy, we defined set of surface markers, using machine learning, which enable easy identification of all defined ECs types.In conclusion, the performed analysis allowed to identify a previously not described population of ECs, which is probably part of the hematopoietic niche. Surface markers for identifying all ECs subpopulations have also been proposed.

W organizmie wszystkie komórki krwi wywodzą się z rzadkiej populacji hematopoetycznych komórek macierzystych (ang. HSC). Ważną rolę w podtrzymaniu i regulowaniu funkcjonowania HSC odgrywa niszą hematopoetyczną– wyspecjalizowana, heterogenna grupa komórek tworząca ich mikrośrodowisko w szpiku kostnym. Pomimo intensywnych badań prowadzonych w tej dziedzinie wciąż brak konsensusu co do dokładnej budowy i położenia niszy. Obecnie większość badań wspiera istnienie niszy przynaczyniowej, której istotną częścią są komórki śródbłonka (ang. Endothelial cells, ECs). Nie ma jednak zgody co do rodzaju naczyń, przy których ma się ona znajdować. Z tego powodu celem pracy była identyfikacja frakcji ECs uczestniczących w tworzeniu niszy hematopoetycznej.Założyliśmy, że frakcja ECs budująca niszę hematopoetyczną oddziałuje z komórkami HSC i multipotencjalnymi komórkami progenitorowycmi (ang. MPP) na drodze specyficznych interakcji molekularnych, które można wskazać na podstawie danych z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Wykorzystaliśmy dane ECs uzyskane przez trzy niezależne zespoły badawcze.Komórki podejrzewane o interakcje z poszczególnymi typami komórek hematopoetycznych zostały wytypowane na podstawie ilości pojedynczych interakcji molekularnych pomiędzy tymi komórkami. Informacja o interakcjach molekularnych pochodziła z ręcznie potwierdzonej bazy odziaływań pomiędzy receptorami błonowymi a ligandami błonowymi, wydzielniczymi i należącymi do macierzy zewnątrzkomórkowej. Ekspresja ligandów w pojedynczych komórkach była zdefiniowana wartością logiczną zgodnie z zasadami logiki rozmytej. Wartość ta była uzyskiwana z ekspresji danego genu przekształconej funkcją logistyczną o parametrach dostosowanych do ekspresji tego genu.W połączonych danych podzielono komórki zgodnie z ustanowionymi typami śródbłonka, jak również zidentyfikowano nie opisaną jak dotąd frakcję. Analiza interakcji biorąca pod uwagę wszystkie rodzaje ligandów pozwoliła wskazać nie opisaną frakcję komórek jako komórki o wyjątkowo silnych interakcjach z komórkami HSC i MPP. Analiza biorąca pod uwagę jedynie ligandy błonowe wykazywała interakcje o porównywalnej sile dla komórek arteriolarnych i sinusoidalnych. Wyniki te nie pozwoliły rozstrzygnąć między niszą arteriolarną i sinusoidalną, sugerują jednak istnienie niszy opartej na nowej populacji komórek śródbłonka. Wskazują również na brak odrębnej niszy dla komórek HSC. Aby ułatwić identyfikację tej nowej populacji ECs w metodach cytometrycznych i mikroskopowych, użyto metod uczenia maszynowego do identyfikacji genów białek powierzchniowych umożliwiających najłatwiejsze rozróżnienie między tymi komórkami.Przeprowadzona analiza pozwoliła zidentyfikować nie opisaną jak dotąd populację ECs, która najprawdopodobniej stanowi część niszy hematopoetycznej. Zaproponowano również markery powierzchniowej pomocne w jej identyfikacji.