Mechanism of internalization: analysis of HyCoSuL 105 probe endocytosis into human neutrophils

Neutrofile będące pierwszym mechanizmem obrony przed patogenami, posiadają szeroki arsenał cech biologicznych umożliwiających im efektywne spełnianie swojej funkcji. Jednym z tych mechanizmów jest obecność antybakteryjnych proteaz serynowych występujących w ziarnistościach neutrofili. Do proteaz neutrofilowych zaliczamy między innymi elastazę neutrofilową, zaangażowaną w chemotaksję oraz migracje neutrofili. Badanie ludzkiej elastazy neutrofilowej dotychczas było utrudnione z powodu braku metod pozwalających na badanie wyłącznie formy aktywnej. Co więcej obrazowanie neutrofili z wybarwioną proteazą tylko mogło odbywać się po uprzednim utrwaleniu komórki. Zastosowanie sondy HyCoSuL 105 pozwoliło znieść te ograniczenia. Sondy te zawierają specyficzną sekwencję dla danej proteazy połączoną z fluoroforem Cy5. Proces wnikania sondy do neutrofili nie został jeszcze zbadany. Endocytoza związków do komórki jest zagadnieniem niezwykle złożonym, decydującym nie tylko o transporcie substancji czy przekazie sygnału a będący w przypadku neutrofili jednym z kluczowych mechanizmów obronnych. W celu badania endocytozy sondy HyCoSuL 105 do neutrofili użyto cytochalazyny D –inhibitora ścieżek internalizacji opartych na cytoszkielecie aktynowym oraz paraformaldehydu powszechnie służącego do utrwalania błony komórkowej. Analize intensywności fluorescencji sondy preinkubowanej z danymi reagentami przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej. Otrzymane wyniki sugerują aktyno-niezależny proces internalizacji sondy HyCoSuL 105 do wnętrza neutrofili, jak również wskazują brak wpływu paraformaldehydu na endocytozę.

Neutrophils which are the first line of the defense against pathogens, have wide spectrum of biological properties, that allows them to fulfill their function. One of their defensive mechanisms are antibacterial serine proteases found in granulocytes. Neutrophil elastase is protease engaged with chemotaxis and neutrophil migration. Research on elastase was hindered by lack of sufficient methods allowing for staining active form of enzyme and also due to inability to visualize live cells. Novel probe HyCoSuL 105 overcame those limits. Probe consists of specific sequence conjugated with fluorophore Cy5 and it’s mechanism of internalization is yet to be known. Endocytosis is an immensely complex issue, it not only directs which molecule will enter the cell or mediates the cells signaling pathways, but is also one of the key defense mechanisms. To investigate internalization of probes HyCoSuL 105 to neutrophils cytochalasin D – inhibitor of actin-dependent endocytosis and paraformaldehyde widely used for fixing cell membrane, were used. Flow cytometry was deployed to assess the probes fluorescence intensity. Results suggest actin independent pathway of internalization of probe and also showed that paraformaldehyde doesn’t affect probe endocytosis.