The role of genetic dominance in masking mutations that increase instability of the genome of Saccharomyces cerevisiae

Niestabilność genetyczna może wynikać z nieprawidłowego funkcjonowania lub braku funkcjonowania, jednego z setek genów biorących udział w replikacji, naprawie lub segregacji materiału genetycznego. Pytaniem szczególnie istotnym jest jak często efekt destabilizujący ujawni się przy połowicznej inaktywacji, ponieważ najczęściej zmutowany jest tylko jeden z dwóch alleli komórki diploidalnej. Badanie niestabilności genetycznej jest istotne ze względu na jego rozpowszechnienie w przypadku wszelkich ludzkich nowotworów. Drożdże Saccharomyces cerevisiae, posiadając niewielki genom, liczący 16 chromosomów, stanowią cenny organizm modelowy służący do badania zjawisk jakim jest niestabilność genetyczna.W niniejszej pracy magisterskiej chciałam eksperymentalnie sprawdzić czy wśród kilkudziesięciu delecji genów drożdżowych wykazujących najsilniejszy efekt destabilizujący w homozygocie są też takie, które wykazują przynajmniej częściową aktywność destabilizującą w stanie heterozygotycznym. Zastosowałam metodę wykrywania utraty heterozygotyczności (LOH, ang. loss of heterozygosity). Używa się jej w przypadku szczepów diploidalnych, w których istnieje reporterowy locus heterozygotyczny. Dzięki temu nawet stosukowo rzadkie zaburzenia mitozy prowadzące do utraty funkcjonalnych alleli są łatwo wykrywalne. Badania rozpoczęłam tworząc kolekcję heterozygot. Dla sprawdzenia czy dochodzi w nich do częstych nieregularności w czasie mitozy prowadzących do utraty heterozygotyczności, użyłam loci diploidalnych pozwalających na wykrycie przejścia heterozygot CAN1/can1 i URA3/ura3 w stan homozygot alleli nieaktywnych can1/can1 i ura3/ura3. Szczepy badałam na 2 podłożach selekcyjnych – zawierającym 5-FOA lub L-kanawaninę. Zaobserwowałam, że dla znacznej większości genów, w obu środowiskach selekcyjnych, heterozygoty genów stabilności genetycznej nie różnią się tempem mutacji LOH od kontroli. Wyjątkiem jest wyraźny efekt destabilizujący heterozygoty IRC3/irc3 i mniejszy, w przypadku kilku innych heterozygot. Tym samym wykazałam, że heterozygoty genu czynnego i w pełni nieczynnego sąnajczęściej wystarczające dla utrzymania stabilności genomu. Moje badania wpisują się w ogólny obraz dominacji genetycznej, czyli potwierdzają, że dominacja alleli typu dzikiego w przypadku braku ekspresji z drugiego allelu jest bardzo silna, nie tylko dla genów podtrzymujących wzrost i przeżywalność, ale także dla genów utrzymujących stabilność genomu.

Instability of the genome can result from malfunctioning of a single gene among hundreds of other ones coding for proteins participating in replication, repair and segregation of the genetic material. Because most mutations within diploid cells are present in heterozygotes, it is especially important to know whether inactivation of only one of the two alleles of such genes is sufficient to result in an increased destabilization of chromosomes. This is relevant to the study of carcinogenesis as most of somatic mutations are heterozygous and the cancer cells have usually high numbers of mutations. The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, has a compact genome constituted by 16 chromosomes and it has been successfully used in former research on genome destabilization. In this experiment, I tested a few dozen gene deletions which were known to be especially destabilizing when in a homozygote. I asked whether they show similar, even if weakened, effect when they form heterozygotes with a functional allele. I applied the classic method of detecting LOH (loss of heterozygosity) in diploid cells in which loci reporting loss of one of alleles are introduced, so that detection of such events is possible even if they are relatively rare. Namely, I used heterozygous loci CAN1/can1 and URA3/ura3 which allow to detect newly arising inactive homozygotes, can1/can1 and ura3/ura3, on selective media containing canavanine or 5-FOA, respectively. I started by constructing the required set of strains which contained a single heterozygote of a gene important for genome stability and the two mentioned above reporter loci. I found that the rate of LOH at both loci was basically indistinguishable from a control strain for nearly all studied heterozygotes. One clear exception was IRC3/irc3, some smaller effects were likely present in a few other strains. In this way, I demonstrated that loci of genes important for genome stability are typically fully functional if only one original allele is present. Strong domination of active over inactive alleles is typical for most of studied phenotypic traits and it appears to exists also for the very special and complex trait of genome stability.