Wygenerowanie molekularnych narzędzi do badania przełączenia między ścieżką tiolacji a urmylacji w szlaku modyfikacji tRNA przez Urm1-Ncs6

Urm1 jest białkiem zaangażowanym w dwie ścieżki – tiolację tRNA i urmylację. Molekularne przyczyny, które powodują wejście Urm1 w jedną lub drugą ścieżkę są dalej nieznane. Posiadanie narzędzi do badania i zrozumienia molekularnego przełącznia między ścieżkami tiolacji i urmylacji pomogłoby w dokładniejszym zrozumieniu mechanizmu tych reakcji. W ścieżce tiolacji Urm1 oddziałuje z Uba4, które może tioestryfikowaći tiokarboksylować Urm1. Odpowiednio zmodyfikowane Urm1 posiadające koniec -COSH transportuje otrzymaną siarkę na kompleks Ncs2/6, który w efekcie końcowym tioluje tRNA. Gdy Urm1 bierze udział w procesie urmylacji również musi być w formie tiokarboksylowanej. Podczas urmylacji Urm1 przez C-terminalną glicynę wiąże się do reszt lizyny specyficznych celów. Zrozumienie roli i znaczenia specyficznych reszt aminokwasowych wspomnianych białek pomogłoby w dogłębnmym zrozumieniu procesów, w których odgrywają kluczową rolę. Co za tym idzie lepszym zrozumieniu wpływu defektów modyfikacji tRNA na związane z nimi choroby. Również wyjaśnienie przyczyn defektów modyfikacji tRNA umożliwiłoby zastosowanie nowego podejścia i projektowania bardziej ukierunkowanych terapii.Celem tej pracy było stworzenie narzędzi do zrozumienia przełączenia Urm1 między ścieżką tiolacji a urmylacji. Stworzono różne mutanty Urm1 i potwierdzono, że w dalszym ciągu są zdolne do przeprowadzania urmylacji. Dodatkowo zaprojektowano kilkanaście mutantów Uba4 by sprawdzić wpływ wybranych reszt na funkcje białka. Pokazano, że cysteina 202 odgrywa ważną rolę w procesie tioestryfikacji i hydrolizy ATP. Cysteina 397 okazała się być krytyczną w procesie tiokarboksylacji.

Urm1 is a Ubiquitin-like protein involved in two pathways – tRNA thiolation and protein urmylation. Molecular regulators which direct Urm1 to either one of the processes are yet unknown. Generating the biochemical tools to study and understand the molecular switch between thiolation and urmylation will promote a morethorough understanding of the underlying mechanisms of these reactions. Urm1 in the thiolation pathway interacts with Uba4 that has the ability to thioestrificate and thiocarboxylate C-terminal carboxyl group of Urm1-COOH. Correctly modified Urm1-COSH then transfers the sulfur atom to the Ncs2/6 complex, finally resulting in tRNA thiolation. When Urm1 is participating in urmylation reaction it first needs to be in thiocarboxylated form. In this pathway, Urm1 is conjugating to Lysine residues on specific targets by its C-terminal Glycine. Understanding the role and importance of specific amino acid residues of mentioned proteins will facilitate a deeper understanding of the key processes they play a role, in particular in the context the influence tRNA modification defects have in a variety of disorders. This could also create new approaches and novel possibilities in designing targeted therapies. In this thesis, the aim was to create molecular tools for the study of the switch between Urm1 thiolation and urmylation. Different Urm1 mutants were generated and were shown to still be capable of performing urmylation. Additionally, a number of Uba4 mutants were produced to study the influence of chosen mutation sites on the protein functions. Cysteine 202 was shown to be important in thioesterification and ATP hydrolysis. Cysteine 397 was confirmed to be critical in the thiocarboxylation reaction.