The effect of PAD4 on the prothrombin activation process

Cytrulinacja to modyfikacja posttranslacyjna polegająca na konwersji łańcucha bocznego argininy w łańcuchu polipeptydowym do cytruliny. W konsekwencji modyfikacja ta powoduje wzrost masy białka lub polipeptydu o 1 Da, lokalny wzrost hydrofobowości oraz utratę ładunku dodatniego na rzecz obojętnego, co z kolei może wpływać na zmianę struktury drugo- i trzeciorzędowej cytrulinowanego białka. W szerszej perspektywie cytrulinacja może mieć wpływ na aktywność zmodyfikowanego białka, jego oddziaływanie z fizjologicznymi partnerami czy zmieniać jego podatność na proteolizę. Cytrulinacja u człowieka jest katalizowana przez enzymy z grupy deiminaz peptydyloargininy - PAD1-4 i PAD6 (ang. peptidylarginine deiminase). Enzymy te są wewnątrzkomórkowe, jednak w stanach patologicznych, takich jak na przykład reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) obserwuje się obecność cytrulinowanych białek poza komórką. Postuluje się, że do uwolnienia PAD4 z komórek immunologicznych, w których ulega ekspresji, dochodzi podczas nekrozy lub tworzenia neutrofilowych pułapek zewnątrzkomórkowych. Patologiczna aktywność PAD4 jest związana z szeregiem chorób o podłożu zapalnym w tym z reumatoidalnym zapaleniem stawów, gdzie nadmierna cytrulinacja białek doprowadza do rozpoznawania ich jako obce dla organizmu i produkcji przeciwciał skierowanych przeciwko tym białkom. W konsekwencji doprowadza to do zaostrzenia stanu zapalnego w stawach i niszczenia ich tkanek. W płynie stawowym pacjentów z RZS zidentyfikowano wiele cytrulinowanych białek, zarówno strukturalnych jak i o funkcjach enzymatycznych – proteaz serynowych oraz ich inhibitorów. Sugeruje to możliwość wielowymiarowego wpływu cytrulinacji na równowagę proteolityczną w organizmie. W poniższej pracy magisterskiej postanowiono więc zbadać wpływ PAD4 na proces aktywacji protrombiny – kluczowej proteazy biorącej udział w kaskadzie krzepnięcia krwi. Za pomocą znakowania sondami specyficznymi dla reszt cytruliny potwierdzono, że cytrulinacja może zachodzić w natywnej sekwencji pełnej formy protrombiny. Ponadto dzięki testom aktywności zarówno na małym, syntetycznym substracie fluorescencyjnym jak i fizjologicznym substracie jakim jest fibrynogen udowodniono, że z cytrulinowanej protrombiny aktywowanej przez swój fizjologiczny aktywator - czynnik Xa – generowana jest większa ilość aktywnej trombiny niż w przypadku natywnej formy. Analiza wzorów prążków powstałych po działaniu Xa na cytrulinowaną i natywną protrombinę pozwoliła określić, że do modyfikacji dochodzi głównie w łańcuchu ciężkim trombiny.

Citrullination is a post-translational modification that converts the arginine side group in the polypeptide chain to citrulline. Consequently, this modification causes an increase in the mass of the protein or polypeptide by 1 Da, local increase in hydrophobicity and loss of a positive charge towards the neutral one, which may in turn change the secondary and tertiary structure of a modified protein. In a broader perspective citrullination may affect the activity of a modified protein, its interaction with physiological partners or change its susceptibility to proteolysis. Human citrullination is catalyzed by the peptidylarginine deiminase, PAD1-4 and PAD6. These enzymes are intracellular, however in pathological conditions such as for example rheumatoid arthritis (RA), citrullinated proteins are present outside of cells. It is postulated that release of PAD4 expressed in immune cells occurs during necrosis or the formation of neutrophilic extracellular traps (NETs). The pathological activity of PAD4 is associated with several inflammatory diseases, including rheumatoid arthritis, where excessive citrullination of proteins promotes their recognition as foreign to the body causing production of antibodies against these proteins. Therefore, it leads to exacerbation of inflammation in the joints and destruction of their tissues. Many citrullinated proteins, both structural and enzymatic like serine proteases and their inhibitors have been identified in the joint fluid of RA patients. This suggests the possibility of a multidimensional influence of citrullination on the proteolytic homeostasis in the body. The following thesis attempted to investigate the effect of PAD4 on the activation process of prothrombin - a key protease involved in the blood coagulation cascade. By labeling with probes specific to citrulline residues, it was confirmed that citrullination could occur in the native sequence of the full length prothrombin. In addition, employing the activity tests on a small, synthetic fluorescent substrate and a physiological substrate fibrinogen, it has been proven that citrullinated prothrombin activated by its physiological activator - factor Xa - generates a greater amount of active thrombin than the unmodified form. The analysis of the band patterns resulting from the action of Xa on citrullinated and native prothrombin showed that the modification mainly occurs in the heavy chain of thrombin.