Błona komórkowa stanowi podstawową barierę dla infekcji wirusowej, a białka obecne na jej powierzchni decydują o specyficzności tkankowej wirusa. By materiał genetyczny wirusa otoczkowego dotarł do wnętrza komórki musi dojść do fuzji jego otoczki z błoną komórkową. W niektórych przypadkach proces ten zachodzi na powierzchni komórki, podczas gdy w innych poprzedzony jest internalizacją do przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem naturalnych mechanizmów komórkowych, za pośrednictwem których komunikuje się ona ze środowiskiem i pozyskuje składniki odżywcze. Głównym celem tej pracy było zidentyfikowanie mechanizmów pozwalających psiemu koronawirusowi oddechowemu (ang. Canine Respiratory Coronavirus, CRCoV) na wejście do komórki. Cel ten osiągnięto poprzez identyfikację receptorów wirusa, poznanie jego drogi wejścia do komórki oraz określenia miejsca fuzji z błoną gospodarza. CRCoV to wirus związany z zakaźną chorobą układu oddechowego psów znaną jako kaszel kenelowy - wysoce zaraźliwą chorobą o niskiej śmiertelności, w której przebiegu występują zarówno infekcje wirusowe jak i bakteryjne. Stwierdzono, że wirus wykorzystuje kwasy sjalowe (ang. sialic acids, SAs) do adhezji do powierzchni komórki, jednak cząsteczki te nie są kluczowe dla infekcji, jako że ich zablokowanie nie hamuje zakażenia. Odbudowa otoczki kwasów sjalowych przywróciła zdolność wirusa do wiązania się do powierzchni komórki, potwierdzając rolę SAs jako czynników adhezyjnych, dodatkowo wykazując preferencję CRCoV do α2,3-SA. Ponieważ niedobór SAs jedynie częściowo hamował adhezję wirusów, przetestowano inne związki identyfikując siarczan heparanu jako alternatywny czynnik adhezyjny. Ponieważ wykazano, że SAs nie służą jako receptory wejścia CRCoV zbadano ludzkie antygeny zgodności tkankowej klasy 1 (ang. human leukocyte antigen class 1, HLA1) postulowane w przeszłości jako zaangażowane w wejście ludzkich koronawirusów HCoV-OC43 i HCoV-HKU1. Zablokowanie interakcji wirusa z HLA1 skutkowało hamowaniem infekcji wykazując jego rolę w procesie wejścia CRCoV. Oprócz CRCoV w badaniu uwzględniono dwa inne blisko spokrewnione koronawirusy: bydlęcego koronawirusa (ang. Bovine Coronavirus, BCoV) oraz HCoV-OC43 wywołujące choroby u innych gospodarzy, pomimo wyjątkowo wysokiego podobieństwa ich genomów. Dalsze etapy wejścia CRCoV zostały zbadane za pomocą mikroskopii konfokalnej, poprzez analizę kolokalizacji wirionów z markerami komórkowymi, oraz ich zachowania w komórkach w których zaburzona została funkcja konkretnych ścieżek (chemiczne inhibitory, wyciszanie wyrażania genów z wykorzystaniem siRNA). Wykazano, że CRCoV dostaje się do komórki z wykorzystaniem endocytozy zależnej od kaweoliny i dynaminy. Ponadto, inaczej niż w przypadku większości koronawirusów wymagających dużo niższego pH i wyższej aktywności katepsyn, jako miejsce fuzji błon zidentyfikowane zostały wczesne endosomy. Wyniki przedstawione w tej pracy poszerzają naszą wiedzę na temat początkowych etapów zakażenia koronawirusami i mogą w przyszłości wspomóc badania nad nowymi lekami przeciwwirusowymi. Jest to szczególnie istotne w kontekście zdolności koronawirusów do przekraczania bariery międzygatunkowej z zachowaniem wysokiej transmisji w ludzkiej populacji, wywołując zagrażające życiu choroby, co zostało udowodnione przez SARS-CoV, MERS-CoV oraz SARS-CoV-2. Gęstość zaludnienia i mobilność, urbanizacja i wylesianie, degradacja środowiska naturalnego i wiele innych czynników sprawia, że choroby odzwierzęce mają coraz większe znaczenie dla zdrowia publicznego. Trzy blisko spokrewnione wirusy zdolne infekować różnych gospodarzy wydają się być dobrym modelem do badania tego zjawiska.
The initial interaction between a virus and the cell is a major determinant of virus tropism. To initiate the infection, enveloped viruses fuse with the cell membrane, and eject their genetic material into a host cell's cytoplasm. In some cases, this process occurs on the cell surface, while in others prior internalization to the endosomal compartment is required. In the latter case, viruses hijack endocytic machinery through which the cell communicates with the environment and acquires nutrients. The main goal of this study was to elucidate the mechanism of entry of Canine Respiratory Coronavirus (CRCoV) to the cell. This aim was achieved by the identification of the cellular receptor, but also by mapping the virus entry route and the virus-cell membrane fusion site. CRCoV is associated with canine infectious respiratory disease, also known as kennel cough - a multifactorial disease with high morbidity but low mortality, involving both viral and bacterial agents. CRCoV was found to utilize sialic acids (SAs) for attachment to the cell surface, but these molecules seem to be non-essential for the virus, as blockade of the interaction did not affect virus entry. The role of SAs during the attachment process was further confirmed, as the reconstitution of the sialic layer restored the virus's ability to attach to the cell surface, additionally showing CRCoV preference to α2,3-SAs moieties. As SAs removal did not entirely hamper virus attachment, other compounds were examined, and heparan sulfate was identified as an alternative attachment site. Because the results showed that SAs does not serve as entry receptors for CRCoV, human leukocyte antigen class 1 (HLA1) reported previously to facilitate the entry of HCoV-OC43 and HCoV-HKU1 was tested. The role of this molecule in the entry process was shown by blocking the interaction between the virus and HLA1. Aside from CRCoV, two other closely related coronaviruses: bovine coronavirus (BCoV) and human coronavirus OC43 (HCoV-OC43) were included in this study. Genetically they are almost identical, but they cause different diseases in different hosts. Further steps of CRCoV entry were mapped in an observatory study, where colocalization of virions with cellular markers was analyzed and in cells with disturbed function of particular pathways (chemical inhibitors, RNA interference). CRCoV was found to initiate infection via dynamin-dependent caveolin-1-mediated endocytosis. Furthermore, the moment of fusion between the virus and cell membranes was tracked to the early endosomal compartment, differently from most of the coronaviruses which travel farther along the endocytic pathway to access endosomes characterized by high cathepsin activity. The research presented in this study broadens our knowledge about the initial stages of coronavirus infection and, in the future, may support the research on new antivirals. This is especially important, as coronaviruses possess the ability to cross the species border, maintaining high human-to-human transmission and may cause life-threatening diseases in a serologically naïve human population, as proven by SARS-CoV, MERS-CoV, and recently by SARS-CoV-2. Population density and mobility, urbanization and deforestation, natural environment degradation and many other factors make zoonoses increasingly relevant to global health. The three genetically similar viruses, infecting different hosts, seem to be a sound model system to study the phenomenon.
