Próba opracowania systemu ekspresji oraz izolacji homologu laktokokcyny 972 kodowanego na plazmidzie pMW2 u Staphylococcus aureus

Bakteriocyny są to syntetyzowane rybosomalnie peptydy o działaniu bakteriobójczym lub bakteriostatycznym względem szczepów bakterii blisko spokrewnionych z ich producentem. W 1996 roku odkryto laktokokcynę 972 – białko z tej grupy produkowane przez Lactococcus lactis IPLA 972, charakteryzujące się cechami nie pozwalającymi zaklasyfikować go do żadnej z klas w dotychczas uznawanej klasyfikacji bakteriocyn. W ostatnich latach odkryto na plazmidzie pMW2 wyizolowanym z gronkowca złocistego obecność operonu kodującego białko homologiczne do tej bakteriocyny. Szczep, z którego wyizolowano plazmid, Staphylococcus aureus CH24, jest zaliczany do metycylinoopornych szczepów gronkowca złocistego (MRSA), wywołujących trudne do wyleczenia infekcje, najczęściej w środowisku szpitalnym. Obecność genu homologu laktokokcyny 972 w genomie szczepu MRSA jest czynnikiem umożliwiającym bakteriom z tego szczepu skuteczniejszą konkurencję o zasoby środowiska z zasiedlającymi je innymi gatunkami i szczepami bakterii, w tym potencjalnie z komensalną mikroflorą organizmu człowieka. Niniejsza praca jest kontynuacją rozpoczętego wcześniej w Zakładzie Biochemii Analitycznej projektu wykorzystującego metody współczesnej biotechnologii w celu produkcji w układzie heterologicznym i oczyszczania dojrzałej formy wspomnianego białka – etapów niezbędnych do dalszej jego charakterystyki. W pracy wykazano, że główną przyczyną wcześniejszych trudności w uzyskaniu nadekspresji dojrzałej formy laktokokcyny 972 w Escherichia coli BL21(DE3) nie była, jak przypuszczano, obecność rzadkich dla tego szczepu kodonów w ciele genu. Doprowadzono także do nadekspresji zmodyfikowanej formy wspomnianego białka zawierającej metkę HQ-tag na N-końcu oraz wykazano produkcję niewielkich ilości bakteriocyny z metką His-tag za pomocą immunodetekcji. Podjęto także próbę wyprodukowania bakteriocyny w S. aureus RN4220 oraz wzmocnienia naturalnej produkcji w S. aureus CH24. Zrealizowane badania dostarczają danych doświadczalnych wskazujących kierunek dla doświadczeń naukowych wykonywanych w ramach projektu w przyszłości.

Bacteriocins are ribosomally synthesized peptides of bactericidal or bacteriostatic activity against bacteria closely related to the producer strain. In 1996 lactococcin 972 was discovered – a protein belonging to this group produced by Lactococcus lactis IPLA 972, displaying unusual characteristics and thus not belonging to any of previously distinguished bacteriocin classes. In recent years an operon encoding lactococcin 972 homologue was discovered on plasmid pMW2 isolated from Staphylococcus aureus CH24. The strain belongs to methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) group, which comprises of strains causing infections difficult to treat, especially in the hospital environment. The presence of lactococcin 972 homologue in a MRSA genome is a factor of more succesful competition between the strain and other bacteria in the environment, potentially including human commensal microbiota. This work is a continuation of a research project previously started at the Department of Analytical Biochemistry utilizing the methods of contemporary biotechnology to set up a heterologous expression system and to purify the mature form of the bacteriocin, which are stages necessary for its further characterization. In this work it is shown that the major reason for earlier difficulties in obtaining protein overexpression in Escherichia coli BL21(DE3) was not the presence of rare codons in the gene body, as previously assumed. Also, overexpression of the N-terminally HQ-tagged bacteriocin was achieved and presence of His-tagged protein in the cell lysate was proven via immunodetection, although in small amounts. An attempt to produce the the bacteriocin in S. aureus RN4220 and to enhance its natural production in S. aureus CH24 was also conducted. The research provides experimental data and indicates the direction of further research carried out as part of the project.