The effects on endoplasmic reticulum stress in neuroblastoma cells due to ch14.18/CHO anti-ganglioside GD2 antibodies and PHLDA1 gene silencing

Nerwiak zarodkowy – neuroblastoma, jest złośliwym nowotworem występującym u pacjentów pediatrycznych, który powstaje z komórek grzebienia nerwowego linii współczulno-nadnerczowej podczas rozwoju embrionalnego. Jednym z podejść w terapii, w przypadku pacjentów wysokiego ryzyka, jest stale rozwijająca się immunoterapia. Zasada działania tej strategii leczenia opiera się na zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko gangliozydowi GD2 obecnemu na powierzchni komórek neuroblastoma. Obecne badania skupiają się na poznaniu molekularnego mechanizmu działania terapii celowanej, co mogłoby pozwolić na zwiększenie efektywności takiej terapii oraz zmniejszenie skutków ubocznych.Celem pracy było zbadanie wpływu przeciwciał ch14.18/CHO wiążących gangliozyd GD2 oraz wyciszenia genu PHLDA1 na stres siateczki śródplazmatycznej w komórkach neuroblastoma. Poziom białek badano w dwóch liniach komórkowych – IMR-32 oraz CHP-134 - wykorzystując metodę Western Blot. W żadnej z linii komórkowych nie zaobserwowano istotnych zmian w poziomie białek związanych ze stresem siateczki śródplazmatycznej pomiędzy komórkami kontrolnymi, a komórkami traktowanymi przeciwciałami ch14.18/CHO. Natomiast, w modelu komórek nowotworowych IMR-32 ze stabilnym wyciszeniem genu PHLDA1, w zależności od badanego białka zaobserwowano inną zależność m.in. w komórkach z wyciszonym PHLDA1 zaobserwowano spadek poziomu białka PERK o ok. 70% oraz wzrost poziomu białka CHOP o prawie 90% w porównaniu do komórek kontrolnych. Ponieważ białko CHOP może być również zaangażowane w inne procesy w modelu wyciszenia PHLDA1, postanowiono zbadać także ścieżkę sygnałową - kaskadę kinaz MAPK w komórkach IMR-32 z wyciszeniem PHLDA1. Na podstawie otrzymanych wyników, w komórkach traktowanych ch14.18/CHO stwierdzono zwiększoną fosforylację jednej z kluczowych kinaz kaskady MAPK - kinazy p38, co wskazuje na wpływ PHLDA1 na aktywność tej kinazy.Wyniki uzyskane w niniejszej pracy umożliwiły wykluczenie stresu związanego z siateczką śródplazmatyczną w komórkach neuroblastoma linii IMR-32 i CHP-134 po zastosowaniu przeciwciał ch14.18/CHO. Pokazały one również wpływ PHLDA1 na białka związane z siateczką śródplazmatyczną oraz kaskadą kinaz MAPK. W niniejszej pracy skupiono się m.in. na omówieniu stresu siateczki śródplazmatycznej w różnych nowotworach, z uwzględnieniem roli białka PHLDA1 oraz możliwym mechanizmie wpływu PHLDA1 na regulację białka CHOP. Poznanie molekularnych mechanizmów działania przeciwciał ch14.18/CHO mogłoby pozwolić na zwiększenie ich skuteczności przez odpowiednie połączenie związków celując w kluczowe procesy dla przeżycia komórek nowotworowych lub inne ważne cele komórkowe.

Neuroblastoma is a malignant tumor occurring in pediatric patients. It is formed from the neural crest cells of the sympathetic-adrenal line during the embryonic development. In case of high-risk neuroblastoma patients, one of still developing approaches is immunotherapy based on the use of antibodies directed against GD2 ganglioside, present on the surface of neuroblastoma cells. The current research focuses on understanding the molecular mechanisms of action of monoclonal antibodies, which could increase the effectiveness of therapy and reduce side effects.The aim of the study was to investigate the effects on endoplasmic reticulum stress in neuroblastoma cells due to ch14.18/CHO anti-ganglioside GD2 antibodies and PHLDA1 gene silencing. The relative expression of proteins was tested in IMR-32 and CHP-134 cells using the Western Blot method. No significant changes in the level of proteins associated with endoplasmic reticulum stress between control and ch14.18/CHO-treated cells were observed in any of the cell lines. The effect of PHLDA1 on endoplasmic reticulum-associated proteins was then investigated in IMR-32 cells with stable PHLDA1 gene silencing. Different effects of PHLDA1 were observed depending on the tested protein. A decrease in the level of PERK protein by approx. 70% and an increase in the level of CHOP protein by almost 90% compared to control cells was observed. As CHOP could also be involved in other processes in the PHLDA1-silenced cells, another signaling pathway - the MAPK cascade was explored. On the basis of the obtained results, in ch14.18/CHO-treated cells, the phosphorylation of one of the key kinases of the MAPK cascade - p38 kinase was shown, indicating an effect of PHLDA1 on the activity of p38 kinase.The results obtained in this study excluded the endoplasmic reticulum stress in IMR-32 and CHP-134 neuroblastoma cells after the use of ch14.18/CHO antibodies. They also showed the effect of PHLDA1 on proteins related to the endoplasmic reticulum and the MAPK signaling. This work focused on endoplasmic reticulum stress in various cancers, the role of PHLDA1 protein and its possible mechanism on the regulation of CHOP protein. Understanding the molecular mechanisms of action of ch14.18/CHO antibodies could increase their effectiveness by combining them with other compounds targeting key processes in cancer cell survival or other important cellular targets.