Testing of PROTACs targeting CDK4 protein for anti-cancer therapies

The cyclin-dependent kinases 4 and 6 (CDK4/6) represent an important point in the control of cell cycle progression. They play a significant role during cell growth, up to the stage of DNA synthesis. Through the phosphorylation of the Rb protein, CDK proteins enable the expression of EF2 transcription factors and further protein synthesis. Studies have shown a link between a loss of regulation of CDK4/6 activity and excessive cell proliferation and tumor growth. Consequently, these kinases have emerged as a promising new target for cancer therapy. Currently, three small molecule inhibitors are approved that are successfully used in the treatment of breast cancer.PROTACs are a novel approach in cancer therapy and are intended to solve the problems of conventional treatments based on small molecules. They are bifunctional compounds, consisting of three components. One part is responsible for attaching to the target protein. Through a linker, it is combined with a ligand that recruits additional protein, an E3 ubiquitin ligase, enabling the degradation of the target protein by the ubiquitin/proteasome system.In this work, the activity of three selected PROTACs was examined in various cell tumor models. In order to achieve the above goal, cells were treated with the selected compounds at various concentrations, to be subsequently analyzed for the expression of CDK4 and CDK6 proteins using the western blot hybridization technique. In addition, studies of the metabolic activity of cells exposed to PROTACs were carried out. As a result of the conducted experiments, the biological activity of MAK 626 and QW 719 compounds was confirmed, while the control MAK 621 probe remained inactive. Among the selected neoplastic models, the strongest effect of the compounds was found against leukemia cell lines. In addition, it was observed that the PROTACs were more powerful in lowering the amount of CDK6 compared to CDK4.To sum up, the goal of the study was achieved and the activity of the PROTACs MAK 626 and QW 719 was confirmed, their ability to reduce the activity of CDK4/6 proteins in selected tumor models.

Kinazy cyklino-zależne 4 i 6 (CDK4/6) stanowią istotny punkt w kontroli progresji cyklu komórkowego. Odgrywają znaczącą rolę podczas wzrostu komórki, aż do etapu syntezy DNA. Poprzez fosforylację białka Rb umożliwiają ekspresję czynników transkrypcyjnych EF2 i dalszą syntezę białek. Badania wskazały na powiązanie niepohamowanej proliferacji komórki i rozwoju nowotworu z utratą regulacji aktywności CDK4/6. W związku z tym kinazy te stały się nowym obiecującym celem terapii przeciwnowotworowej. Obecnie zostały zatwierdzone trzy małocząsteczkowe inhibitory, które są skutecznie wykorzystywane w leczeniu nowotworów piersi. Sondy PROTAC są nowatorskim podejściem w terapii nowotworowej i mają stanowić rozwiązanie problemów konwencjonalnych sposobów leczenia związkami małocząsteczkowymi. Są to bifunkcjonalne związki, składające się z trzech składowych. Jedna z nich ma na celu przyłączenie się do celowanego białka. Jest ona poprzez łącznik chemiczny połączona z ligandem, który rekrutując dodatkowe białko, jakim jest ligaza ubikwityny E3, umożliwia degradację celowanego białka z wykorzystaniem systemu ubikwityna/proteasom. W niniejszej pracy badano aktywność trzech wybranych sond PROTAC na różnych komórkowych modelach nowotworowych. By umożliwić zrealizowanie powyższego celu komórki poddano traktowaniu wybranymi związkami w różnych stężeniach, by kolejno poddać je analizie pod kątem ekspresji białek CDK4 i CDK6 z wykorzystaniem techniki hybrydyzacji western blot. Dodatkowo wykonano testy aktywności metabolicznej komórek podanych traktowaniu sondami. W wyniku przeprowadzonych doświadczeń potwierdzono aktywność biologiczną związków MAK 626 oraz QW 719 oraz stwierdzono jej brak dla kontrolnej sondy MAK 621. Stwierdzono też wśród wybranych modeli nowotworowych najsilniejsze działanie związków wobec linii komórkowych białaczki. Zaobserwowano również mocniejszy efekt w obniżeniu ilości CDK6 w porównaniu do CDK4.Podsumowując, zrealizowano postawiony cel pracy i potwierdzono aktywność sond PROTAC MAK 626 i QW 719 w kierunku obniżenia aktywności białek CDK4/6 w wybranych modelach nowotworowych