Biochemiczna charakterystyka japsyny – zewnątrzkomórkowej proteinazy Candida glabrata oraz jej rola w tworzeniu biofilmu wielogatunkowego z drożdżakami Candida albicans

Każdego roku obserwuje się wzrost liczby zakażeń gatunkami uprzednio uznawanymi za komensalne. Pośród takich patogenów wyróżnić można drożdżaki z rodzaju Candida. Najpowszechniej występującym gatunkiem z tego rodzaju jest Candida albicans, często izolowany z miejsc infekcji razem z innym przedstawicielem - Candida glabrata. Drożdżaki te, przyczyniające się do coraz większej ilości śmiertelnych kandydoz, posiadają szereg mechanizmów zwiększających stopień ich wirulencji. Pośród nich wyróżnia się produkcję białek z rodziny adhezyn, proteinaz aspartylowych oraz formowanie biofilmów zarówno monogatunkowych, jak i mieszanych. Od pozostałych przedstawicieli rodzaju Candida, gatunek C. glabrata wyróżnia brak kluczowej w patogenezie zmiany formy morfologicznej. Nie upośledza to jednak zdolności patogennego drożdżaka do inwazji komórek gospodarza, dlatego postuluje się istotność pozostałych czynników wirulencji w procesie zakażenia. Celem pracy było wyizolowanie, a następnie oczyszczenie proteinazy aspartylowej C. glabrata oraz białek z rodziny adhezyn, określenie optymalnych warunków aktywności proteolitycznej uzyskanej proteinazy oraz weryfikacja możliwości degradacji adhezyn poprzez oczyszczoną proteinazę. Ponadto zbadano wpływ oczyszczonej proteinazy C. glabrata oraz rekombinowanej proteinazy aspartylowej Sap9 C. albicans na formowanie biofilmów monogatunkowych jak i wielogatunkowych przez dwa szczepy C. albicans o różnej wirulentności. Zastosowane metody obejmują m.in. prowadzenie hodowli drożdżaków oraz dwuetapowe oczyszczanie białek z wykorzystaniem metod chromatograficznych. Ocena wpływu proteinaz na biofilmy wykonana została przy użyciu szeregu testów mikropłytkowych, pomiarów gęstości optycznej oraz barwień komórek. Uzyskane wyniki wskazują na brak bezpośredniej obróbki proteolitycznej oczyszczonych białek z rodziny adhezyn przez proteinazę C. glabrata, w zastosowanych warunkach. Obie badane proteinazy wykazały destabilizujący wpływ na biofilmy mieszane drożdżaków, przy czym silniejszy efekt odnotowano dla bardziej wirulentnego szczepu C. albicans.

Every year, an increase in the number of infections caused by species previously considered commensal, is observed. Yeast of Candida species can be distinguished among them. The most prevalent species of this type is Candida albicans, often isolated from the infection site with another representative – Candida glabrata. These yeasts, contributing to the increasing amounts of deadly candidiasis, have several mechanisms to increase their virulence rate. Among them, adhesin and aspartyl proteinase expression, as well as mono-species and mixed-species biofilm formation can be distinguished. The lack of a change of morphological form, key in pathogenesis, distinguishes C. glabrata from other Candida species. However, it doesn’t impair its ability to infect host tissues; hence it is suggested that other virulence factors play essential roles in the invasion process. This work aimed to isolate and purify aspartyl proteinase of C. glabrata and its adhesin proteins, determine the optimal proteolytic activity of purified proteinase and verify its ability to degrade purified adhesins. In addition influence of purified proteinase of C. glabrata and recombined aspartyl proteinase Sap9 of C. albicans on mono-species and mixed-species, formed by two C. albicans strains, was tested. The methods used include: conducting yeast cultivation and two-step protein purification using chromatography methods. Evaluation of the effect of proteinases against biofilms was done using several microplate tests, optical density measurements and cell staining. Results show a lack of direct proteolytic processing of purified adhesins by C. glabrata proteinase in used conditions. Both proteinases demonstrated destabilizing impact on mixed-species yeast biofilms; however more powerful effect was noted for the more virulent C. albicans strain.