Study of the phenotype of transfected cell lines with IDH1 and IDH2 gene mutations by Raman spectroscopy

Acute myeloid leukemia (AML) is one of the most common types of leukemia diagnosed in adults with the risk increasing with age. Genetic mutations are detected in more than 97% of diagnosed AML patients. The genes IDH1 and IDH2 encode isomers of isocitrate dehydrogenase, an enzyme responsible for catalyzing oxidative decarboxylation of isocitrate to α-ketoglutaric acid. Mutations in these genes are responsible for changing the product of the reaction to 2-hydroxyglutarate, which accumulates in cells, and is responsible for the impairment of histone demethylation, which leads to changes in cell metabolism and phenotype. Erythroleukemia is a subtype of AML that occurs rarely and is often diagnosed too late – erythroleukemia remission occurs in 62% of patients.Raman imagining is an often used technique in biological samples with no sample preparation required. It allows to image samples under physiological conditions. Raman spectra provide information on the molecular structure. With the help of chemometric methods, Raman spectra can be used for full spectral characterization of molecules and identification of spectral markers of said molecules.This study aimed to investigate changes in HEL cell metabolism and phenotype induced by IDH1 and IDH2 gene mutations using Raman imagining and chemometric methods and analysis of chemical composition of these cells. The mutations investigated in this thesis were IDH1/R132H, IDH2/R140Q, and IDH2/R172K. The experiments and research conducted proved that Raman imagining coupled with chemometric methods is a technique that can be used to determine transfection-induced changes in all cells examined. Mutations caused subtle but significant changes in cellular metabolism that were noticeable with the use of the principal component analysis (PCA) for IDH2 mutated cells and the partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) for IDH1 mutated cells. The built PLS models for IDH2/R172K and IDH2/R140Q cells had particularly good sensitivity and specificity.In conclusion, Raman spectroscopy shows the potential of a method that can be used in the identification of clinical diagnostic and metabolic changes caused by single-gene mutations in cells.

Ostra białaczka szpikowa jest najczęściej występującą białaczką u osób dorosłych, a ryzyko na zachorowanie zwiększa się wraz z wiekiem. Mutacje genetyczne wykrywane są w ponad 97% diagnozowanych przypadków AML. Geny IDH1 i IDH2 kodują enzymy dehydrogenazy izocytrynianowej 1 i 2. Rearanżacje genów IDH1 i IDH2 powodują, że enzymy te wytwarzają 2-hydroksyglutaran, który jest akumulowany w komórkach i powoduje upośledzenie demetylacji histonów, co prowadzi do zmian w metabolizmie i fenotypie komórek. Erytroleukemia to jedna z najrzadziej występujących odmian białaczki szpikowej, która jest późno diagnozowana i wiąże się z gorszą prognozą przeżycia pacjenta – wyleczenie jest możliwe, ale reemisja choroby występuje u 62% pacjentów.Obrazowanie ramanowskie staje się coraz częściej wykorzystywanym narzędziem w badaniach próbek biologicznych ze względu na możliwość prowadzenia pomiarów w warunkach fizjologicznych oraz bez konieczności specjalnego przygotowywania próbek. Widma ramanowskie dostarczają informacji o strukturze molekularnej cząsteczek, które analizowane z wykorzystaniem metod chemometrycznych pozwalają na pełną charakterystykę spektralną oraz wytypowanie markerów spektralnych. Celem pracy było zbadanie wpływu mutacji IDH1 i IDH2 na fenotyp oraz metabolizm komórek HEL za pomocą obrazowania ramanowskiego oraz z wykorzystaniem metod chemometrycznych. Badanymi mutacjami były IDH1/R132H, IDH2/R140Q oraz IDH2/R172K. Obrazowanie ramanowskie, sprzężone z technikami chemometrycznymi, umożliwiło ocenę, czy transfekcja przebiegła pomyślnie oraz jakie zmiany w metabolizmie komórek zaszły na jej skutek. Wprowadzenie mutacji spowodowało wystąpienie subtelnych, ale znaczących zmian w metabolizmie komórek, które można było zaobserwować w analizie głównych składowych (PCA) dla komórek z mutacjami IDH2 oraz w analizie dyskryminacyjnej metodą najmniejszych cząstkowych kwadratów (PLS-DA) dla komórek z mutacją IDH1. Modele zbudowane dla komórek IDH2/R172K oraz IDH2/R140Q w trakcie analizy PLS wyróżniły się bardzo dobrą czułością i swoistością.Podsumowując, wykazano, że spektroskopia ramanowska ma potencjał w diagnostyce klinicznej ostrej białaczki szpikowej, a także w identyfikacji zmian metabolicznych, spowodowanych mutacjami pojedynczych genów w komórkach.