Macrophages are one of the cell populations of the immune system that are particularly involved in the innate immune response. Within numerous macrophage populations, resident cells, such as Browicz-Kupfer cells residing in the blood vessels of the liver, can be distinguished. The latter macrophage population is exposed to factors present in blood, including hemoglobin and heme unleashed from lysed erythrocytes. The process that leads to the disintegration of erythrocytes and the release of their content is called hemolysis. In a physiological state, damaged and aging red blood cells are removed by efferocytosis i.e. phagocytosis by resident macrophages. In contrast, pathological conditions such as hemolytic anaemia or severe sepsis, lead to uncontrolled rapture of blood cells. In the current thesis a hypothesis was tested that components released from erythrocytes can activate macrophages and impact their immune parameters. In the studies hemolysates obtained from different erythrocyte counts (0,25 thous. 2,5 mil; 25 mil) were investigated and tested for their effect on mouse macrophages of RAW 264.7 cell line. The effect of hemolysate on viability, mitochondrial activity, expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and the production of nitric oxide (NO) was tested. Hemolysate obtained from 2,5 mil erythrocytes was shown to reduce both the viability and the mitochondrial activity of macrophages and to have no stimulating effect on nitric oxide production. In contrast, hemolysate obtained from 25 mil erythrocytes resulted not only in decreased mitochondrial activity, but also in increased macrophage viability, iNOS expression and NO production. In summary, the strong hemolysis of erythrocytes, which leads to the lysis of numerous cells, activates macrophages towards pro-inflammatory phenotype by increasing iNOS expression and NO production. In addition, an important goal of the studies was to evaluate application of colorimetric tests in hemolysate research. The thesis presents limitations of their use, shows the results of additional tests (on medium and serum effects on the hemolysate coloration) and a methodological approach that allows a correct interpretation of the results obtained from the colorimetric tests.
Makrofagi są jedną z populacji komórek układu immunologicznego, szczególniezaangażowanych w odpowiedź wrodzoną. W obrębie licznych populacji makrofagówwyróżniamy komórki osiadłe (rezydentne), takie jak, obecne w naczyniach krwionośnychwątroby, komórki Browicza-Kupfera. Tego typu populacje makrofagów są narażone nadziałanie czynników obecnych we krwi, w tym uwolnionych z erytrocytów, hemoglobinyi hemu. Proces, który prowadzi do rozpadu erytrocytów i uwolnienia ich zawartości nosinazwę hemolizy. W stanie fizjologicznym, uszkodzone i starzejące się krwinki sąusuwane w procesie eferocytozy, poprzez ich fagocytozę przez osiadłe makrofagi.Natomiast w stanach patologicznych, np. niedokrwistościach hemolitycznych czy teżpodczas ciężkiego przebiegu sepsy, zachodzi niekontrolowana hemoliza krwinek. Wniniejszej pracy testowano hipotezę, postulującą, że uwolnione składniki erytrocytówmogą aktywować makrofagi i wpływać na ich parametry immunologiczne. W badaniachwykorzystano hemolizat, pozyskany z różnej liczby erytrocytów (250 tys. 2,5 mln;25 mln) i badano jego wpływ na mysie makrofagi linii komórkowej RAW 264.7.Testowano wpływ hemolizatu na żywotność, aktywność mitochondrialną oraz ekspresjęindukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) i produkcję samego tlenku azotu (NO).Wykazano, że hemolizat pozyskany z 2,5 mln erytrocytów obniżył zarówno żywotnośćjak i aktywność mitochondrialną makrofagów oraz nie wpłynął stymulująco na produkcjętlenku azotu. Natomiast hemolizat pozyskany z 25 mln erytrocytów nie tylkospowodował spadek aktywności mitochondrialnej, ale wpłynął także na zwiększenieżywotności makrofagów, jak i ekspresję iNOS oraz produkcję NO. Podsumowując, silnahemoliza erytrocytów, prowadząca do lizy licznych komórek, stymuluje makrofagi doprozapalnej odpowiedzi immunologicznej poprzez zwiększenie ekspresji iNOS orazodpowiednio - produkcji NO. Dodatkowo, ważnym zadaniem w obrębieprzeprowadzonych badań, było oszacowanie możliwości wykorzystywania w badaniachnad hemolizatem testów kolorymetrycznych. W pracy opisano wykazane ograniczeniaich stosowania, przedstawiono wyniki dodatkowo przeprowadzonych testów (wpływmedium i surowicy na zabarwienie hemolizatu) oraz wskazano podejście metodologiczneumożliwiające poprawną interpretację wyników uzyskanych z testówkolorymetrycznych.
