Oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych anty ludzki TNFα i sprawdzenie ich przydatności w technikach analitycznych

This paper presents the process of purifying and testing the activity of both human tumor necrosis factor alpha (hTNFα) and its specific anti-hTNFα monoclonal antibody. The biological activity assay was performed on two cell lines: the human HeLa line and the murine Mc38 line. Human TNFα induces nitric oxide synthesis in Mc38 cells and interleukin 6 in HeLa cells. Purified monoclonal antibodies obtained from anti-hTNFα hybridoma cell clone were tested for effects on hTNFα activity by analyzing changes in stimulated cell arrangement. Purified immunoglobulins have been shown to neutralize the activity of the cytokine to a varying extent. In the case of Mc38 cells, NO synthesis was completely inhibited, while the inhibition of Il-6 synthesis in HeLa cells was not complete. The EMSA analysis revealed one of the mechanisms of hTNFα action, based on the activation of the NfκB transcription factor in HeLa cells. The biochemical characteristics of the obtained antibodies also showed the possibility of using purified proteins in selected analytical techniques, such as: ELISA, Western Blot and Dot Blot. Additionally, an attempt was made to optimize the culture of a hybridoma cell clone by replacing the serum with selected supplements.

W niniejszej pracy przedstawiono proces oczyszczania oraz badania aktywności zarówno ludzkiego czynnika martwicy nowotworów alfa (hTNFα), jak i specyficznego względem niego przeciwciała monoklonalnego anty-hTNFα. Oznaczenie aktywności biologicznej przeprowadzono na dwóch liniach komórkowych: ludzkiej linii HeLa i mysiej Mc38. Ludzki TNFα indukuje syntezę tlenku azotu w komórkach Mc38, a w komórkach HeLa-interleukiny 6. Oczyszczone przeciwciała monoklonalne, pozyskane z klonu komórek hybrydoma anty-hTNFα, były badane pod kątem wpływu na działanie hTNFα poprzez analizę zmian w stymulowanych układach komórkowych. Wykazano, że oczyszczone immunoglobuliny w różnym stopniu neutralizują działanie cytokiny. W przypadku komórek Mc38 nastąpiło całkowite zahamowanie syntezy NO, natomiast hamowanie syntezy Il-6 w komórkach HeLa, nie było całkowite. Analiza wykonana metodą EMSA uwidoczniła jeden z mechanizmów działania hTNFα, oparty o aktywację czynnika transkrypcyjnego NfκB w komórkach HeLa. W charakterystyce biochemicznej pozyskanych przeciwciał wykazano również możliwość wykorzystania oczyszczonych białek w wybranych technikach analitycznych, takich jak: ELISA, Western Blot oraz Dot Blot. Dodatkowo podjęto próbę optymalizacji hodowli klonu komórek hybrydoma poprzez zastąpienie surowicy wybranymi suplementami.