Development of an in vivo protein cage-based system for supercharged protein engineering via directed evolution

Supercharged proteins are an inconspicuous group of proteins endowed with an extraordinarily high net charge. Their characteristics, such as resistance to aggregation and the ability to penetrate eukaryotic cells, are particularly desirable in the field of biomedicine and applied biochemistry. Thus, attempts have been made to engineer synthetic supercharged variants of other proteins. However, state-of-the-art in silico methods often yield variants with no activity or its severe impairment compared to their parents. Directed evolution has been proposed as an approach supplementary to in silico protein design. This method includes generation of libraries of random mutants and high-throughput screening for variants with desired properties.The aim of this study was to establish a system to single out functional, supercharged variants from mutant libraries, founding a basis for the development of a directed evolution-based protein supercharging strategy.The system exploits protein cages possessing a negatively charged lumen, able to encapsulate oppositely charged proteins in vitro. The research within the thesis showed that for certain cages, this phenomenon also occurs in Escherichia coli cells. A model supercharged fluorescent protein was equipped with a degradation peptide, directing the protein towards specific proteolysis. In flow cytometry analyses, fluorescence originating from the undegraded fusion protein was observed in cells where its coproduction with certain protein cages took place. In contrast, no similar effect ensued if a protein cage was absent, which was the case as well in corresponding experiments with a non-supercharged homologue. These results demonstrated that the rescue effect of the protein cage is selective and only applies to supercharged variants of a given protein. Moreover, its occurrence in vivo renders the system useful for the directed evolution approach. The study also featured the design and analysis of an auxiliary system for the recognition of variants devoid of the degradation peptide due to mutagenesis, based on the translational coupling of a reporter gene. Additionally, the efficiency of a novel algorithm for in silico protein supercharging was verified, having been implemented for a protein scaffold that has not been tested yet, and a setup for the initial stages of its mutant library generation was proposed.The study established an outline of a high-throughput strategy for the identification of supercharged variants of a protein in a pool of mutants. The method shown in the thesis is an outset for the development of a novel direction in experimental approach for the engineering of supercharged proteins, which is an indispensable complement to computational techniques of limited efficiency.

Białka nadnaładowane (od ang. supercharged proteins) to niewielka grupa białek o ponadprzeciętnie wysokim ładunku wypadkowym. Ich osobliwe właściwości, takie jak opieranie się agregacji i zdolność do penetracji komórek eukariotycznych, są szczególnie pożądane w dziedzinie biomedycyny i biochemii stosowanej. Z tego powodu usiłuje się tworzyć na ich wzór syntetyczne, nadnaładowane warianty innych białek. Niestety, warianty projektowane obecnie dostępnymi metodami in silico najczęściej wykazują brak aktywności lub jej upośledzenie w stosunku do białek wyjściowych. Jako podejście komplementarne do projektowania in silico proponuje się wdrożenie ewolucji sterowanej. Podejście to obejmuje tworzenie obszernych bibliotek losowych mutantów i wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku identyfikacji wariantów o poszukiwanych właściwościach.Celem niniejszych badań było zaprojektowanie systemu do identyfikacji nadnaładowanych wariantów białek w bibliotekach mutantów, stanowiącego podwaliny do rozwoju opartej na ewolucji sterowanej strategii inżynierii białek nadnaładowanych.System oparto na klatkach białkowych o ujemnie naładowanym lumenie, które są w stanie dokonywać enkapsulacji przeciwnie naładowanych białek in vitro. W ramach pracy wykazano, że zjawisko to zachodzi dla niektórych klatek białkowych również w komórkach Escherichia coli. Modelowe, nadnaładowane białko fluorescencyjne wyposażono w peptyd degradacyjny, kierujący białko ku specyficznej proteolizie. W analizach techniką cytometrii przepływowej zaobserwowano pochodzącą od niezdegradowanego białka fuzyjnego fluorescencję komórek, w których zachodziła jego koprodukcja wraz z klatką białkową. Podobnego efektu nie wykazano z kolei w przypadku, gdy produkcja klatki białkowej nie zachodziła, a także w analogicznych eksperymentach z homologicznym białkiem pozbawionym wysokiego ładunku. Świadczy to o selektywnych właściwościach ochronnych klatki wyłącznie względem nadnaładowanych wariantów danego białka, a fakt ich występowania również in vivo czyni system przydatnym z punktu widzenia ewolucji sterowanej. W pracy ujęto również projektowanie i analizę pomocniczego systemu rozpoznawania wariantów pozbawionych peptydu degradacyjnego wskutek mutagenezy, opartego o sprzężenie translacyjne genu reporterowego. Ponadto, z użyciem nowego algorytmu zweryfikowano efektywność projektowania białek nadnaładowanych in silico dla niepoddawanego wcześniej próbom nadnaładowania białka i zaproponowano przebieg wstępnych etapów tworzenia biblioteki jego mutantów.Powyższe badania demonstrują zarys wysokoprzepustowej strategii identyfikacji nadnaładowanych wariantów białka w puli mutantów. Strategia ta stanowi punkt wyjścia do opracowania nowego kierunku eksperymentalnej inżynierii białek nadnaładowanych, będącej niezbędnym uzupełnieniem technik obliczeniowych o ograniczonej skuteczności.