Kompensacja efektów heterozygotycznych mutacji unieczynniających białko przez zmiany w ekspresji funkcjonalnych alleli w wybranych szczepach drożdży.

Compensation in response to changes in gene copy number in Saccharomyces cerevisiae has been examined for many years. So far, yeast responses to chromosomal aneuploidy and gene deletions have been well studied, but there is a lack of research on changes in mRNA levels caused by gene inactivating point mutations. It is believed that regardless of the type of change, most of the genes are not compensated, and haploinsufficiency is an extremely rare phenomenon in yeast. The aim of this study was to check whether the knockdown of one gene copy would result in increased expression of this gene (compensation), and additionally to develop and test the methodology for examining gene expression compensation using the real-time PCR method. The research was carried out on six experimental genes: RPL15B, OPT2, MET7, NAT4, SIC1 and SLG1. In the yeast strains selected for the experiment (Peter et al., 2018), these genes had (or should have) a heterozygous point mutation changing the reading frame or inserting a premature stop codon. As a result of this mutation, there has been formed a non-functional mRNA and protein. For each experimental strain, there was selected a control strain without any mutations in the given gene. The cell culture has been kept under constant conditions, then the RNA isolation was performed and the level of transcripts was determined by reverse transcription and real-time PCR. Additionally, DNA sequencing of the tested genes was performed to confirm the presence of mutations described in the literature. The results showed that two of the six selected genes did not have the desired mutation, so these genes were excluded from further study. The final results indicated that only one of the tested genes had an increased expression and showed compensation, for two genes presumably no compensation happened, but it cannot be excluded since nonsense mediated decay (NMD) could have occurred. The expression level of the last of the genes was low enough to exclude the possibility of compensation.

Kompensacja w odpowiedzi na zmiany liczby kopii genów u Saccharomyces cerevisiae jest przedmiotem badań od wielu lat. Dotychczas dobrze zbadano reakcje drożdży na aneuploidie chromosomalne i delecje genów, ale brakuje badań na temat wpływu mutacji punktowych unieczynniających gen na zmiany poziomu mRNA. Uważa się, że niezależnie od rodzaju zmiany, większość badanych genów nie jest kompensowana, a haploinsuficjencja jest niezwykle rzadkim zjawiskiem u drożdży. Celem niniejszej pracy było sprawdzenie, czy knockdown jednej kopii genu spowoduje, że dojdzie do podwyższonej ekspresji tego genu (kompensacji), oraz dodatkowo opracowanie i przetestowanie metodologii badania kompensacji ekspresji genów przy użyciu metody real-time PCR. Badania przeprowadzono na sześciu genach eksperymentalnych: RPL15B, OPT2, MET7, NAT4, SIC1 i SLG1. W wybranych do eksperymentu szczepach drożdży (Peter i in., 2018) geny te miały (lub powinny mieć) heterozygotyczną mutację punktową zmieniającą ramkę odczytu, lub wstawiającą przedwczesny kodon stop. Efektem takiej mutacji było powstanie niefunkcjonalnego mRNA i białka. Do szczepów eksperymentalnych dobrano także szczepy kontrolne z niezmutowaną wersją danego genu.Hodowla badanych szczepów drożdży miała miejsce w stałych warunkach, po czym przeprowadzono izolację RNA i określono poziom transkryptów za pomocą reakcji odwrotnej transkrypcji i real-time PCR. Dodatkowo przeprowadzono sekwencjonowanie DNA badanych genów w celu potwierdzenia obecności opisanych w literaturze mutacji. Jego wynik pokazał, że dwa z sześciu wybranych genów nie posiadały wskazanej mutacji, więc geny te zostały wykluczone z dalszych badań. Ostateczne wyniki wskazały, że tylko jeden z badanych genów miał wyraźnie zwiększoną ekspresję i wykazywał kompensację, dla dwóch genów prawdopodobnie nie zaszła kompensacja, ale nie można jej wykluczyć, ponieważ mogło zajść zjawisko NMD (ang. nonsense mediated decay). Natomiast poziom ekspresji ostatniego z genów był na tyle niski, że można z całą pewnością wykluczyć zajście kompensacji.