Śmierć ludzkich neutrofili w warunkach hipoksji

Neutrophils are the most abundant leukocyte population in human peripheral blood. They are the first to be mobilized into the infection site and they possess a wide arsenal of weapons to fight pathogens such as phagocytosis, degranulation, and NET-osis. Neutrophils have a relatively short life span, less than 20 hours, after which they die usually via spontaneous apoptosis. Tight regulation of neutrophil cell death is essential to maintain homeostasis and, in case of inflammation, to stop the immune response. Neutrophils’ cell death type that has been researched the most is apoptosis; however, they can also die via inflammatory lytic cell death such as necrosis and pyroptosis. In the case of the latter through the activation of the inflammasome, the immature forms of pro-inflammatory interleukins (pro-IL-1β, pro-IL-18) are changed into their mature forms and released from the cell through gasdermins pores in the cell membrane. Neutrophils are often mobilized to places with low oxygen levels, as a part of their immune responses. These places are referred to as hypoxic. Hypoxia stimulates numerous metabolic pathways in the cell to adapt to the new environment. The main transcription factor which is activated during hypoxia is HIF-1. It regulates many processes such as erythropoiesis, angiogenesis, and cell death. Hypoxia can stimulate and inhibit the death of the cell, though the mechanism of regulation is not completely known. The aim of this thesis was the analysis of the influence of hypoxia on neutrophil cell death. The focus was the research on spontaneous apoptosis, apoptosis after LPS stimulation, lytic cell death, and pyroptosis after NLRP3 inflammasome stimulation. It was shown that hypoxia inhibits spontaneous apoptosis in neutrophils. LPS stimulation slowed their death via apoptosis, which effect was strengthened in hypoxic conditions. A similar influence of hypoxia was seen in lytic cell death as cells cultured in hypoxic conditions showed better cell membrane integrity than those incubated in normoxia. Hypoxia was shown to stimulate survival after stimulation of pyroptosis as the cells incubated in hypoxic conditions showed smaller amounts of released IL-1β and better cell membrane integrity.To summarize, this thesis shows evidence that hypoxia stimulates neutrophil survival via inhibiting apoptosis and lytic cell death including apoptosis.

Neutrofile to najliczniejsza populacja leukocytów w krwi obwodowej człowieka. Jako pierwsze mobilizowane są do miejsca zakażenia i posiadają szeroki arsenał metod walki z patogenem, do których należą m.in. fagocytoza, degranulacja i NET-oza. Neutrofile posiadają stosunkowo krótki czas życia wynoszący mniej niż 20 godzin, po którym umierają najczęściej wskutek spontanicznej apoptozy. Ścisła regulacja śmierci neutrofili jest niezbędna dla zachowania homeostazy, a w przypadku stanów zapalnych wygaszania odpowiedzi odpornościowej. Najgłębiej zbadanym typem śmierci neutrofili jest apoptoza, aczkolwiek komórki te ulegają również śmierci typu litycznego, o charakterze prozapalnym, do których zaliczamy m.in. nekrozę czy pyroptozę. W przypadku tej ostatniej, w wyniku aktywacji inflamasomu, prekursorowe formy cytokin prozapalnych (pro-IL-1β oraz pro-IL-18) przekształcane są w ich formę dojrzałą oraz uwalniane z komórki najczęściej poprzez pory gazderminowe. Neutrofile w ramach swojej funkcji często mobilizowane są do miejsc z niską zawartością tlenu, które określamy jako hipoksyczne. Warunki hipoksji stymulują szereg szlaków metabolicznych mających na celu adaptację komórki do nowego środowiska. Głównym czynnikiem transkrypcyjnym aktywowanym w warunkach hipoksji jest HIF-1. Wpływa on na szereg procesów takich jak: erytropoeza, angiogeneza oraz śmierć komórkowa. Hipoksja może stymulować jak i hamować śmierć komórki, a sam mechanizm regulacji nie został do końca poznany.Celem pracy była analiza wpływu warunków hipoksji na śmierć komórkową neutrofili. Skupiono się na zbadaniu spontanicznej apoptozy neutrofili, ich apoptozy po stymulacji LPS-em, śmierci o charakterze litycznym jak i pyroptozy po stymulacji inflamasomu NLRP3. Wykazano, iż warunki hipoksji hamują spontaniczną apoptozę neutrofili. Stymulacja komórek LPS-em spowolniła ich śmierć na drodze apoptozy, który to efekt został wzmocniony w przypadku komórek inkubowanych w warunkach hipoksji. Podobny wpływ hipoksji zauważono w przypadku analizy śmierci litycznej, w której to wykazano, iż komórki hodowane w warunkach hipoksji wykazywały mniejszą utratę ciągłości błony komórkowej, w porównaniu z hodowlą inkubowaną w normoksji. Po aktywacji inflamasomu NLRP3, w warunkach hipoksji zaobserwowano również niższy poziom pyroptozy i uwalnianej IL-1β. Podsumowując, w pracy przedstawiono dowody przemawiąjące za tym, iż warunki hipoksji sprzyjają przeżyciu neutrofili hamując apoptozę oraz śmierć lityczną m.in pyroptozę.