LAMA2-related muscular dystrophy (LAMA2-MD) is a congenital disease caused by mutations in LAMA2 gene encoding laminin alpha2. Together with beta and gamma chains, this protein assembles into cross-like shape molecule which constitute a part of extracellular matrix (ECM). Clinical picture of LAMA2-MD includes hypotonia, muscular weakness, decrease of muscle spontaneous movements and contractures, feeding difficulties with failure to thrive, aspiration, recurrent lung infections and delayed musculoskeletal development. Several animal models have been developed to study the molecular basis of these pathological alterations, however for better understanding of the disease, human cell-based models are needed. Accordingly, human induced pluripotent stem cells (hiPSC) provide a novel tool to address this issue as they demonstrate the capacity to self-renew and differentiate into the derivatives of all three germ layers, including skeletal muscle cells and cardiomyocytes. Additionally, combination of hiPSC technology and CRISPR/Cas9 gene editing allows for generation of isogenic cell lines which differ only in the defined genomic locus, limiting the genetic heterogeneity of hiPSC derived from different donors. Therefore, the aim of this study was to apply previously obtained isogenic control and laminin alpha2-deficient hiPSC, with complete deletion of LAMA2 exon 3, to study the LAMA2-MD-related alterations in myogenesis with the particular focus on the phenotype of satellite cells. For that purpose, cells were subjected to myogenic differentiation using commercially available Skeletal Muscle Differentiation kit, RNA was collected at early stage of the process when muscle stem cells occurred and subjected to global transcriptomic analysis. Performed experiments revealed multiple signalling pathways, including those related to NOTCH and Hedgehog factors, as well as more than 1000 genes affected by the lack of laminin alpha2. Further investigation confirmed altered expression of HMOX1 and indicated increased level of FOXO3 as well as decreased level of PAX7 and MAP1LC3C. Finally, to address the issue of off-target activity of sgRNAs used to obtain LAMA2-knockout hiPSC, CRISPR/Cas9 method was applied to derive a novel line with frameshift mutation in LAMA2 exon 7. Successful abrogation of laminin alpha2 expression was confirmed in hiPSC-derived myotubes using Western blot method. Importantly, upon differentiation of this line into satellite cells, quantitative PCR analysis confirmed previously observed pattern of change in the expression of HMOX1, PAX7 and MAP1LC3C. Overall, experiments performed in frame of this Master Thesis indicate that isogenic control and laminin alpha2-deficient hiPSC provide a valuable tool for LAMA2-MD disease modelling.
LAMA2-zależna dystrofia mięśniowa (LAMA2-MD, ang. LAMA2-muscular dystrophy) jest wrodzoną chorobą spowodowaną mutacjami w genie LAMA2 kodującym lamininę alfa2. Wraz z łańcuchami beta i gamma białko to tworzy kompleks o kształcie krzyża, który stanowi część macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM, ang. extracellular matrix). Obraz kliniczny LAMA2-MD obejmuje hipotonię, osłabienie, zmniejszenie spontanicznych ruchów mięśni, przykurcze, trudności w połykaniu oraz oddychaniu, nawracające infekcje płuc oraz opóźniony rozwój mięśniowo-szkieletowy. Opracowano kilka modeli zwierzęcych w celu zbadania podstaw molekularnych tych zmian patologicznych, jednak dla lepszego zrozumienia choroby potrzebne są modele oparte na komórkach ludzkich. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC, ang. human induced pluripotent stem cells) stanowią nowe narzędzie w tym kontekście, ponieważ wykazują zdolność do samo-odnowy i różnicowania w pochodne wszystkich trzech listków zarodkowych, w tym do komórek mięśni szkieletowych i kardiomiocytów. Dodatkowo, połączenie technologii hiPSC i metody edycji genów CRISPR/Cas9 pozwala na otrzymanie izogenicznych linii komórkowych, które różnią się jedynie określonym locus genomowym, ograniczając genetyczną heterogenność hiPSC pochodzących od różnych dawców. Biorąc to pod uwagę, celem pracy było zastosowanie wcześniej uzyskanych izogenicznych linii hiPSC: kontrolnej oraz z niedoborem lamininy alfa2, spowodowanym całkowitą delecją eksonu 3 genu LAMA2, do badania zaburzeń w procesie miogenezy, charakterystycznych dla LAMA2-MD, ze szczególnym uwzględnieniem fenotypu komórek satelitarnych. hiPSC poddano różnicowaniu do komórek mięśniowych za pomocą dostępnego na rynku zestawu Skeletal Muscle Differentiation, na wczesnym etapie procesu, kiedy pojawiły się komórki satelitarne, pobrano RNA i poddano globalnej analizie transkryptomicznej. Przeprowadzone eksperymenty ujawniły wiele ścieżek sygnałowych, w tym związanych z czynnikami NOTCH i Hedgehog, a także ponad 1000 genów zmienionych w grupie pozbawionej lamininy alfa2. Dalsze badania potwierdziły zmienioną ekspresję HMOX1 i wskazały na podwyższony poziom FOXO3 oraz obniżony poziom PAX7 i MAP1LC3C. W ostatnim kroku, aby sprawdzić czy uzyskane wyniki nie były związane z niespecyficzną aktywnością cząsteczek sgRNA użytych do otrzymania linii hiPSC z delecją eksonu 3 LAMA2, zastosowano metodę CRISPR/Cas9 w celu wyprowadzenia nowej linii z mutacją przesunięcia ramki odczytu w eksonie 7 tego genu. Brak ekspresji lamininy alfa2 w komórkach mięśni szkieletowych pochodzących z otrzymanej linii hiPSC potwierdzono przy użyciu metody Western blot. Co ważne, po jej zróżnicowaniu do komórek satelitarnych, ilościowa analiza PCR potwierdziła obserwowany wcześniej wzorzec zmian w ekspresji HMOX1, PAX7 i MAP1LC3C. Podsumowując, eksperymenty przeprowadzone w ramach tej pracy magisterskiej wskazują, że izogeniczne linie hiPSC: kontrolna oraz z niedoborem lamininy alfa2 stanowią cenne narzędzie do modelowania dystrofii mięśniowej LAMA2-MD.
