Comparative analysis of glycoslation profiles in normal, cancerous thyroid cells and their extracellular vesicles

Glikozylacja jest jedną z ważniejszych modyfikacji białek. Decyduje o kierowaniu białek do konkretnych kompartmentów komórki, sekrecji pozakomórkowej, reguluje wiele oddziaływań komórkowych. Transformacja nowotworowa przyczynia się do zmian w obrębie glikanów na powierzchni komórek, a tym samym prowadzi do zakłócenia prawidłowych oddziaływań, czy nabycia przez komórki nowych właściwości. Ektosomy – jedna z subpopulacji mikropęcherzyków błonowych – zdolne są do pogłębienia inwazyjnego charakteru komórek nowotworowych. Aktualnie brak informacji o roli glikozylacji ektosomów w biologii nowotworów tarczycy. Celem pracy było porównanie profilów glikozylacji komórek tarczycy prawidłowych (nabłonek pęcherzykowy, linia Nthy-ori 3-1) oraz zmienionych nowotworowo (rak anaplastyczny, linia 8305C) oraz uwalnianych przez nie ektosomów. Ektosomy izolowano z pożywki kondycjonowanej metodą wirowania różnicowego. Czystość uzyskanych frakcji ektosomalnych weryfikowano wykorzystując analizę ruchu nanocząstek (NTA) oraz transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM). Charakterystykę białek obecnych w homogenatach komórkowych, frakcjach błonowych i ektosomalnych prowadzono z wykorzystaniem panelu sześciu biotynylowanych lektyn o znanej specyfice, po ich uprzednim rozdziale metodą SDS-PAGE i elektroblottingu, a następnie wykonano pomiary densytometryczne intensywności poszczególnych prążków. Przeprowadzone analizy (TEM i NTA) potwierdziły, że próbki używane w dalszych badaniach reprezentowały frakcje ektosomalne. Najwyższe wartości intensywności prążków stwierdzono po reakcji z lektynami: Phaselous vulgaris (erytroaglutynina), Galanthus nivalis, Maackia amurensis oraz Sambucus nigra. Jednakże wartości intensywności białek MAA-, ale również SNA- i GNA-pozytywnych w linii 8305C osiągały w frakcji ektosomalnej odpowiednio: wyższe bądź zbliżone wartości w porównaniu do linii Nthy-ori 3-1, czego nie wykazano w przypadku reakcji z pozostałymi lektynami; jedyny wyjątek stanowi reakcja z lektyną Aleuria aurantia, dla której odnotowano wyższą intensywność prążków w linii 8305C, ale wyłącznie w frakcji błonowej. Ogółem białek AAA-pozytywnych było niemal tyle samo w każdej z analizowanych frakcji w obu liniach komórkowych i jednocześnie białka te cechowały się zbliżonymi wartościami intensywności. W linii komórek prawidłowych białek PHA-E-pozytywnych było więcej niż w linii komórek zmienionych nowotworowo i miały podobne wartości intensywności prążków, wyłączając białka wykryte w frakcji błonowej linii 8305C. W linii tej, stwierdzono również najwięcej białek PHA-E-pozytywnych w frakcji ektosomalnej. Z kolei białek GNA- i PHA-L-pozytywnych w linii Nthy-ori 3-1 było więcej niż linii 8305C, ale wykazywały one odpowiednio: zbliżone oraz wyraźnie wyższe wartości intensywności prążków (we wszystkich frakcjach) w porównaniu do linii komórek raka anaplastycznego. W reakcjach z obiema lektynami w linii 8305C, najwięcej białek stwierdzono w frakcji homogenatu i błonowej, tymczasem w frakcji mikropęcherzyków białek GNA- i PHA-L-pozytywnych było najmniej. W linii Nthy-ori 3-1 w frakcji ektosomalnej obserwowano spadek liczby białek MAA- oraz SNA-pozytywnych w porównaniu do frakcji błonowej. Przeciwne tendencje wykazano w linii komórek nowotworowych. Potrzebne są dalsze badania, które pozwoliłyby na stwierdzenie, czy możemy mieć do czynienia z potencjalnym glikobiomarkerem raka anaplastycznego.

Glycoslation is one of the most important modifications of protein. It is responsible for directing proteins to specific cell compartments, extracellular secretions. It also regulates many cellular interactions. The cancer transformation make changes in glycans on the surface of cells. Thus it may leads to the disruption of the correct interactions or the acquisition of new properties by the cells. Ectosomes - one of the subpopulation of membrane microvesicles - can make the invasive nature of cancer cells even worst. Currently there is no information about the role of glycoslation of ectosomes in thyroid carcinomas. The main aim of the study was to compare the glycoslation profile of thyroid cells (follicular epithelium, Nthy-ori 3-1 line) and cancerous (anaplastic carcinoma, 8305C line) and ectosomes released by them. Ectosomes were isolated from a conditioned media by sequential centrifugation. The purity and effectiveness of the obtained ectosomal fraction was verified using the nanoparticles analysis (NTA) and transmission electron microscopy (TEM). The characteristics of proteins present in cell extract fraction, membrane and ectosomal fraction was obtained using the six biotin-liked lectines with known specificity. But previously for each cell line, all fractions with lectins were separated by SDS-PAGE and elektroblotting method. Then there was carried out densitometric measurement of the intensity of every single band (from lectinblotting). The analyzes (TEM and NTA) confirmed that the samples represented the ectosomal fractions. The highest values of band intensity were noted for lectins: Phaselous vulgaris (erytroaglutinin), Galanthus nivalis, Maackia amurensis and Sambucus nigra. In the 8305C line in the ectosomal fraction the band intensity achieved for MAA-, SNA- and GNA-positive proteins was respectively higher or similar compared the Nthy-ori 3-1 line. That was also the only observation for the 8305C line all analyzed lectins given; the only exception is the reaction with Aleuria aurantia lectin. Here was noted a higher bands intensity in the 8305C line, but only in the membrane faction. In total, in both cell lines in each of the analyzed fractions the number of AAA-positive proteins were almost the same. AAA-positive proteins were also similar intensity values in both cell lines. There were more PHA-E-positive proteins in the Nthy-ori 3-1 line than in the 8305C line; there also had similar values of band intensity, excluding proteins detected in the membrane fraction of the 8305C line. In this line, there were also found the biggest number of PHA-E-positive proteins in the ectosomal fraction. But in the Nthy-ori 3-1 line there were more GNA- and PHA-L-positive proteins than in the 8305C line. There were also observed, respectively: similar and higher values of the bands intensity of GNA- and PHA-L-positive proteins (all factions) compared to the anaplastic carcinoma cell line. In the 8305C line for both lectins, the most pronounced number of proteins were noted in the homogenate and membrane faction. There were simultaneously the smallest number of this proteins in the microvesicles fraction. In the Nthy-ori 3-1 line, there was observed a decrease in the number of MAA- and SNA-positive proteins in the ectosomal fraction compared to the membrane fraction. The opposite trends were noted in the 8305C line. Further tests are needed. They would allow future scientists find potential glycobiomarker of anaplastic carcinoma.