Ocena funkcjonalności neutrofili różnicowanych w warunkach in vitro: ocena spontanicznej apoptozy neutrofili

Neutrophils also known as polymorphonuclear leucocytes (PMN) are the most abundant cells of the immune system and the first to fight microbes at the site of infection. PMN have several crucial defense mechanisms and are irreplaceable in their role. They are formed in the bone marrow and characterized by a short lifespan (half-life of 8-20 hours) and a complex structure. In this master’s dissertation neutrophils differentatied in vitro from CD34+ cells derived from peripheral blood and induced pluripotent stem cells (iPSC) from two cell lines: JD6 and RN were analyzed. The aim was to evaluate whether, using the presented experimental model it is possible to obtain neutrophils functionally similar to those isolated from human peripheral blood. The phenotype of the obtained neutrophils was checked (CD11b, CD16, CD15 and CD10 markers) and their ability to spontaneous and induced apoptosis. The results showed that with in vitro differentiation of JD6 and RN neutrophils in different media and CD34 + cells, we obtained CD15 + cells with each differentiation, which constituted about 30% of the analyzed population, but the population of mature cells, CD11b and CD16 positive, differed, because a greater percentage of mature neutrophils was obtained after differentiation of line JD6 in X-VIVO. For CD15 + and CD10 + cells checked at different time points after culture in RPMI at any time point regardless of lineage, their number did not exceed 5%. Neutrophils differentiated in vitro, although morphologically similar to those isolated from peripheral blood differ in functionality, namely in terms of entering spontaneous apoptosis after 24 hours. In the experiments shown in this master’s dissertation the percentage of apoptotic cells was very low.

Neutrofile zwane też leukocytami wielopłatowo jądrzastymi (ang. polymorphonuclear leucocytes, PMN), jako najliczniejsze komórki układu immunologicznego i pierwsze w miejscu infekcji do walki z drobnoustrojami, posiadają kilka ważnych mechanizmów obronnych i są niezastąpione w swojej roli. Powstają w szpiku kostnym i charakteryzują się krótkim czasem życia (okres półtrwania 8-20 godzin) oraz złożonością struktury. W niniejszej pracy analizowano neutrofile różnicowane in vitro, z komórek CD34+ pochodzących z krwi obwodowej oraz indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). iPSC różnicowane były, z dwóch linii komórkowych: JD6 i RN. Przy ich różnicowaniu wykorzystano protokół, polegający na stworzeniu konstruktu 3D tzw. embryoid body (EB) i hodowanie komórek w dwóch różnych pożywkach: APEL i X-VIVO. Celem było zbadanie, czy przy wykorzystaniu przedstawionego modelu doświadczalnego, uzyskamy neutrofile pod względem funkcjonalnym podobne do tych, wyizolowanych z krwi obwodowej człowieka. Sprawdzany był fenotyp uzyskanych neutrofili (markery CD11b, CD16, CD15 i CD10) oraz ich zdolność do spontanicznej i indukowanej apoptozy. Uzyskane wyniki pokazały, że przy różnicowaniu neutrofili in vitro z linii JD6 i RN w różnych mediach oraz komórek CD34+ uzyskaliśmy komórki CD15+ przy każdym różnicowaniu, które stanowiły około 30% analizowanej populacji, ale różniła się populacja dojrzałych komórek, CD11b i CD16 pozytywnych, ponieważ większy odsetek dojrzałych neutrofilii uzyskano po różnicowaniu linii JD6 w X-VIVO. W przypadku komórek CD15+ i CD10+ sprawdzanych w różnych punktach czasowych po hodowli w RPMI w żadnym punkcie czasowym bez względu na linię, ich ilość nie przekroczyła 5%. Neutrofile różnicowane in vitro mimo tego, że pod względem morfologicznym przypominają te wyizolowane z krwi obwodowej, to pod względem funkcjonalnym a konkretnie wchodzenia w spontaniczną apoptozę po 24h hodowli, różnią się. W przeprowadzonych doświadczeniach odsetek komórek apoptotycznych był bardzo niski.