Zaprojektowanie i optymalizacja systemu służącego do ilościowej i jakościowej analizy powstawania granul stresowych w komórkach linii HeLa

Stress granules are non-membranous cellular organelles that appear in the cytoplasm during a cell's response to stress. In recent years, stress granules have become a common subject of research in the context of cancer cells' response to anti-cancer therapy, including hyperthermia combined with radio- and chemotherapy. Stress granules are mainly studied in terms of the cell response to stress caused by heat shock, osmotic shock, as well as arsenic and selenium compounds.The presented results are part of a project aimed at explaining the role of the G3BP1 protein in the formation of stress granules, as well as creating a universal system for imaging and analyzing stress granules using live-cell fluorescence microscopy.This system is based on the transfection of a cell line with a vector with selected antibiotic resistance (hygromycin or blasticidin) and a recombinant stress granule marker - G3BP1 protein fused with the fluorescent protein Clover or mScarlet.Establishing stable cell lines with fluorescently labeled G3BP1 protein enables live observation of the mechanism of stress granule formation after introducing a stress inducing factor into the cell environment. Interestingly, the morphology and quantity of stress granules in cells differ depending on the administered factor. Thanks to the possibility of analyzing the formation of stress granules in a time-dependent manner, it has also been shown that the time of stress granule formation for individual cells varies and depends on the intensity of the factor, such as the concentration of sodium (meta)arsenite. The stoichiometry of the G3BP1 protein is an important factor during stress granule formation. To achieve the desired level of G3BP1 protein expression in the studied cells, a stable line was established with endogenous G3BP1 silencing and simultaneous introduction of exogenous fluorescently labeled G3BP1 protein.

Granule stresowe są nieobłonionymi organellami komórkowymi, występującymi w cytoplazmie podczas odpowiedzi komórki na stres. W ostatnich latach granule stresowe stały się częstym przedmiotem badań w kontekście odpowiedzi komórek nowotworowych na terapię przeciwnowotworowe m.in. hipertermię skojarzoną z radio- i chemioterapią. Granule stresowe bada się głównie pod kątem odpowiedzi komórki na stres wywołany szokiem cieplnym, szokiem osmotycznym, a także związkami arsenu i selenu.Prezentowane wyniki są częścią projektu, który ma na celu wyjaśnienie roli białka G3BP1 przy powstawaniu granul stresowych, a także stworzenie uniwersalnego systemu służącego do obrazowania i analizy granul stresowych przy pomocy przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej.System ten opiera się na transfekcji linii komórkowej wektorem z wybraną opornością na antybiotyk (higromycyna lub blastycydyna) oraz rekombinowanym markerem granul stresowych - białkiem G3BP1 w fuzji z białkiem fluorescencyjnym Clover lub mScarlet.Wyprowadzenie stabilnych linii komórkowych ze znakowanym fluorescencyjnie białkiem G3BP1 umożliwia przyżyciową obserwację powstawania granul stresowych po wprowadzeniu do środowiska komórek czynnika wywołującego stres. Ponadto morfologia i ilość granul stresowych w komórkach, różni się w zależności od podanego czynnika. Dzięki możliwości analizy powstawania granul stresowych w ujęciu czasowym, udowodniono także, że czas powstawania granul stresowych dla pojedynczych komórek jest różny i zależy od natężenia czynnika np. stężenia metaarseninu sodu. Ważnym czynnikiem podczas powstawania granul stresowych jest stechiometria białka G3BP1. Aby możliwie najlepiej zbliżyć poziom ekspresji białka G3BP1 w badanych komórkach, wyprowadzono stabilną linię z wyciszeniem endogennego G3BP1 z równoczesnym wprowadzeniem egzogennego białka G3BP1 znakowanego fluorescencyjnie.