Characterization of the CDK4 protein and the PD-L1/inhibitor complex as the basis for potential anticancer therapies.

Immunoonkologia jest jedną z metod leczenia chorób nowotworowych, która w przeciwieństwie do konwencjonalnych metod terapii polega na modulacji układu odpornościowego. Ważnym punktem uchwytu wykorzystywanym w immunoterapii są punkty kontrolne układu immunologicznego m.in. szlak PD-1/PD-L1. Komórki nowotworowe, posiadające na swojej powierzchni białko PD-L1, są w stanie unikać odpowiedzi ze strony układu odpornościowego poprzez interakcję z białkiem PD-1, obecnym na powierzchni limfocytów T. Interakcja tych dwóch białek powoduje dezaktywację limfocytów T i zanik odpowiedzi immunologicznej pozwalającej wykrywać szkodliwe komórki nowotworowe. Zastosowanie inhibitorów anty-PD-1 lub anty-PD-L1 znajduje zastosowanie w terapiach m.in. niedrobnokomórkowego raka płuc czy czerniaka. W ostatnich latach amerykańska Agencja Żywności i Leków (ang. FDA) zatwierdziła aż 7 przeciwciał monoklonalnych, stosowanych w immunoterapii jako inhibitory białek PD-1 lub PD-L1. Jednak ze względu na drogi koszt produkcji oraz słabe właściwości farmakokinetyczne tych związków, nadal poszukuje się innych, tańszych małocząsteczkowych inhibitorów o lepszych parametrach farmakokinetycznych i właściwościach antynowotworowych. Kolejnym punktem uchwytu w terapiach przeciwnowotworowych jest cykl komórkowy regulowany przez cytokiny oraz białka CDK (ang. cyclin-dependent kinase). Poprzez tworzenie kompleksu CDK-cyklina możliwa jest kontrola cyklu komórkowego, tym samym możliwe jest zahamowanie namnażania się komórek rakowych charakteryzujących się nieprawidłowym przyrostem. Białko CDK4 tworząc kompleks z cykliną D reguluje przejście z fazy G1 do fazy S cyklu komórkowego. Progresja cyklu jest możliwa dzięki fosforylacji białka retinoblastomy oraz odłączeniu się czynnika transkrypcyjnego E2F. Do tej pory nie została określona krystaliczna struktura białka CDK4 w postaci aktywnej, a konformacja nieaktywna białka odbiega od wcześniej poznanych kompleksów CDK-cyklina. Wskazuję to na szczególny sposób działania białka CDK4, którego dalsza charakterystyka pozwoliłaby na sukcesywny rozwój terapii przeciwnowotworowych. W niniejszej pracy przebadano interakcje małocząsteczkowego inhibitora z białkiem PD-L1 oraz wykonano próby ekspresji bakteryjnej i oczyszczenia białka CDK4.

Immunooncology is one of the types of cancer treatments, which unlike conventional methods of therapy, is based on the modulation of the immune system. An important point of grip used in immunotherapy are the immune checkpoints, e.g. the PD-1/PD-L1 pathway. Cancer cells carrying the PD-L1 protein on their surface are able to evade the immune response by interacting with the PD-1 protein present on the surface of T cells. The interaction of these two proteins causes the inactivation of T cells and the loss of the immune response to detect cancer cells. Anti-PD-1 or anti-PD-L1 inhibitors are used in a wide range of tumors e.g. non-small cell lung cancer or melanoma. In recent years, the US Food and Drug Administration (FDA) has approved 7 monoclonal antibodies that are of PD-1 or PD-L1 proteins. However, due to the expensive cost of production and poor pharmacokinetic properties of these compounds, other, cheaper, small molecule inhibitors with better pharmacokinetic parameters and anticancer properties are still being searched for. Another point of interest in anti-cancer therapies is the cell cycle regulated by cytokines and CDK proteins (cyclin-dependent kinase). By creating the CDK-cyclin complex, it is possible to control the cell cycle, thus inhibiting the multiplication of cancer cells characterized by abnormal growth. The CDK4 protein, forming a complex with cyclin D, regulates the transition from the G1 to the S phase of the cell cycle. The progression of the cycle is possible due to the retinoblastoma protein phosphorylation and detachment of E2F transcription factor. So far, the crystal structure of the CDK4 protein in the active form has not been determined, and the protein's inactive conformation differs from the previously known CDK-cyclin complexes. This indicates a specific mode of action of the CDK4 protein, whose further characterization would allow the development of anti-cancer therapies. This paper describes the interaction of a small molecule inhibitor with the PD-L1 protein as well as an attempt at bacterial expression and purification of the CDK4 protein.