Analiza wpływu pH na orientację przeciwciał immobilizowanych na podłożach krzemowych

Przeciwciała IgG to białka, które są wytwarzane w odpowiedzi na obecność patogenów w organizmie i odgrywają ważną rolę w reakcji immunologicznej. Są one zbudowane z dwóch łańcuchów ciężkich i dwóch łańcuchów lekkich, tworzących cząsteczkę o kształcie litery Y. Regiony wiążące antygen znajdujące się na domenach Fab przeciwciał w zależności od komórek B, które je produkują. Natomiast domena Fc ma stały skład aminokwasowy i strukturę. Region Fc przeciwciał wpływa na ich aktywność i funkcje w układzie odpornościowym. Przeciwciała IgG są używane w immunosensorach, które wykorzystują przeciwciała do wykrywania specyficznych antygenów. Immunosensory znajdują zastosowanie w diagnostyce biomedycznej, bezpieczeństwie żywności i badaniach leków.Orientacja przeciwciał immobilizowanych na powierzchni w testach immunologicznych jest kluczowa dla skuteczności wiązania antygenu. Wyróżnia się cztery różne orientacje przeciwciał na powierzchni: "tail-on", "head-on", "side-on" oraz "flat-on". W orientacji "tail-on" domena Fc przeciwciała jest skierowana w stronę podłoża, a domeny F(ab)2 są skierowane w stronę fazy roztworu. W orientacji "head-on" jest odwrotnie. Orientacje "side-on" i "flat-on" są odpowiednio: boczna i pozioma. Różne orientacje przeciwciał charakteryzują się różnym dostępem do miejsc wiążących i tym samym różną efektywnością wiązania antygenu. Orientacja "tail-on" jest najkorzystniejsza, a "head-on" jest najmniej korzystna z punktu widzenia interakcji przeciwciała z antygenem.W niniejszej pracy przeprowadzono badania nad wpływem warunków immobilizacji na orientację przeciwciał na powierzchni. Skupiono się na pH roztworu oraz sile jonowej, analizując jednocześnie przypadek adsorpcji fizycznej i wiązania kowalencyjnego przeciwciał do powierzchni. W ten sposób znaleziono najlepsze warunki osadzania przeciwciał, zapewniające ich optymalną orientację i zwiększając w ten sposób wydajność immunosensora.W ramach pracy magisterskiej zastosowano trzy różne metody badawcze, a mianowicie: elipsometrię spektralną do analizy efektywności adsorpcji przeciwciał do powierzchni, spektrometrię masową jonów wtórnych z analizatorem czasu przelotu do analizy dominującej orientacji przeciwciał w warstwie oraz spektroskopię odbiciową światła białego w celu oceny efektywności wiązania antygenów do warstw przeciwciał immobilizowanych w różnych warunkach.

IgG antibodies are proteins produced in response to the presence of pathogens in the body and playing an important role in the immune response. IgG anibodies consist of two heavy chains and two light chains forming a Y shape molecule. The antigen binding sites are located on Fab antibody domain and varies depending on the B cells by which were produced. In turn, Fc domain of IgG antibodiy has a constant amino acid composition and structure. The Fc region of antibodies influences their activity and a function in the immune system. IgG antibodies are used in immunosensors that use antibodies to detect specific antigens. Immunosensors are used in biomedical diagnostics, food safety and drug research.The orientation of the surface immobilized antibodies used in immunoassays is critical to antigen binding efficiency. There are four different orientations of antibodies: "tail-on", "head-on", "side-on" and "flat-on". In the "tail-on" orientation, the Fc domain of the antibody faces the substrate and the F(ab)2 domains face the solution phase. In the "head-on" orientation, the opposite is true. Side-on and flat-on orientations are lateral and horizontal, respectively. Different orientations of the antibodies affect access to the antigen binding sites and as the result the antigen binding efficiency. The "tail-on" orientation is the most preferred and the "head-on" is the least favourable in terms of antibody-antigen interaction.In this work, the effect of immobilization conditions on the dominant orientation of surface immobilized antibodies was investigated. An impact of the solution pH and ionic strength was analysed for the physical antibodies absorption and covalent coupling. The optimal conditions for antibody immobilization were determined providing the favourable antibodies orientation and thus increasing the performance of the immunosensor.As part of the master's thesis, three different surfaces since techniques were applied, namely: Spectroscopic Ellipsometry to examine the antibodies adsorption capacity on the surface, Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry to analyse the dominant antibodies orientation, and White Light Reflectance Spectroscopy to evaluate the efficiency of antigen binding to surface immobilized antibodies.