Glycosylation is one of the most important post-translational modifications in both physiological and pathological conditions. During the homeostasis, glycans are responsible among others, for proper protein folding, protection against proteolysis, and intercellular communication, while pathogens use oligosaccharides as a tool to regulate their virulence and infectivity. The best-known types of oligosaccharides are N- and O-glycans, found in all domains of life and on viral envelopes. Despite the dynamic development of glycobiology, we still do not know most of the functions that sugars can play in regulating cellular processes. The zebrafish (Danio rerio) is a model organism used in many studies in the field of immunology and genetics, due to its unique species characteristics. The larval stage is characterized by transparency that allows for intravital tracking of changes taking place in the organism and high susceptibility to genetic manipulation. Because adult specimens are small, have numerous offspring and their breeding is not cost-intensive, they are often used in laboratory research. D. rerio are also highly susceptible to infection with pathogens, including the TiLV virus (Tilapia Lake virus), which is responsible for mass deaths of fish in aquaculture.The aim of my research was to evaluate the effect of TiLV virus infection on the expression of the selected genes encoding glycosyltransferases and glycosidases in the cells of D. rerio larvae and livers. Genes encoding fucosyltransferases (fut8, fut9b), sialyltransferases (st6galnac5a, st6gal1, st3gal4, st8sia7), neuraminidases (neu1, neu4) and other enzymes related to the synthesis of sialic acid (cmah, cmas1) were selected for the analyses. Larvae and adult livers from two independent wild lines: Tübingen and AB x TL were used for the study. The larvae were microinjected into the Cuvier's organ with TiLV virus (strain: VETKU-TV01) in the study groups and L-15 medium in the control groups (CTR). The material for the analysis of gene expression was collected at two time points, 24 and 48 hours after infection (hpi). RNA was isolated using a modified Chomczynski method. Gene expression was analyzed using a two-step real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). RT-qPCR amplicons were also visualized by agarose gel electrophoresis in the presence of ethidium bromide. Statistical analyzes were performed using one- /two-way ANOVA for larvae and one-way ANOVA or Kruskal-Walli’s test for adult livers. A significance level of p<0.05 was assumed. The obtained results indicate a statistically significant increase in the expression of genes encoding fucosyltransferases and neuraminidase 1 in D. rerio larvae infected with TiLV. The significantly higher expression after infection with TiLV were also observed for the cmah gene encoding the hydroxylase responsible for the synthesis of glycolyloneuraminic acid (Neu5Gc). Zebrafish adults show a decreased expression of neu4 and st6galnac5a genes and an increased level of neu1 and st3gal4 on the first day of TiLV infection relative to CTR. In addition, a direct proportional relationship was found between the cmah, neu1, and st3gal4 expression in TiLV-positive larvae and the time of infection.The obtained results indicate that TiLV infection changes the expression level of genes encoding enzymes involved in the glycosylation process in zebrafish cells. Indication of D. rerio larval cells, where changes in glycosylation occur, and the determination of the functional significance of these changes requires further research.
Glikozylacja to jedna z najważniejszych modyfikacji potranslacyjnych zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Podczas homeostazy organizmu glikany odpowiadają m.in. za prawidłowe pofałdowanie białek, ochronę przed proteolizą i komunikację międzykomórkową, natomiast patogeny wykorzystują oligosacharydy jako narzędzie do regulowania swojej wirulencji i zakaźności. Najlepiej poznanymi rodzajami oligosacharydów są N- i O-glikany, spotykane w obrębie wszystkich domen życia oraz na otoczkach wirusów. Pomimo dynamicznego rozwoju glikobiologii, nadal nie poznaliśmy większości funkcji, jakie mogą odgrywać cukry w regulowaniu procesów komórkowych. Danio pręgowany (łac. Danio rerio) to organizm modelowy stosowany w wielu badaniach z zakresu immunologii i genetyki, dzięki swoim unikalnym cechom gatunkowym. Stadium larwalne cechuje się transparentnością pozwalającą na przyżyciowe śledzenie zmian zachodzących w ustroju oraz dużą podatnością na manipulacje genetyczne. Dorosłe osobniki osiągają niewielkie rozmiary, posiadają liczne potomstwo a ich hodowla nie jest kosztochłonna, dlatego są często wykorzystywane w badaniach laboratoryjnych. D. rerio wykazują również dużą podatność na infekowanie patogenami, w tym wirusem TiLV (Tilapia Lake virus), który odpowiada za masową śmierć ryb w akwakulturach.Celem moich badań była ocena wpływu infekcji wirusa TiLV na ekspresję wybranych genów kodujących glikozylotransferazy i glikozydazy w komórkach larw i wątrobie osobników dorosłych D. rerio. Do analiz wybrano geny kodujące fukozylotransferazy (fut8, fut9b), sjalotransferazy (st6galnac5a, st6gal1, st3gal4, st8sia7), neuraminidazy (neu1, neu4) oraz inne enzymy związane z syntezą kwasu sjalowego (cmah, cmas1). Do badań wykorzystywano larwy i wątroby z osobników dorosłych z dwóch niezależnych linii dzikich: Tübingen i AB x TL. Larwy poddano mikroiniekcji wirusem TiLV (szczep: VETKU-TV01) wprowadzonym w narząd Cuviera w grupach badanych oraz pożywką L-15 użytą w grupach kontrolnych (CTR). Materiał do analizy ekspresji genów pozyskano w dwóch punktach czasowych, po upływie 24 i 48 godzin od infekcji (hpi). RNA wyizolowano stosując zmodyfikowaną metodę Chomczyńskiego. Ekspresję genów analizowano stosując dwuetapową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Amplikony RT-qPCR wizualizowano również w rozdziałach elektroforetycznych w żelu agarozowym w obecności bromku etydyny. Analizy statystyczne przeprowadzono z użyciem jedno- oraz dwuczynnikowej ANOVA w przypadku larw i jednoczynnikowej ANOVA lub testem Kruskala-Wallisa w ocenie istotności statystycznej danych uzyskanych dla wątrób z osobników dorosłych. Przyjęto poziom istotności p<0,05. Uzyskane wyniki wskazują na istotny statystycznie wzrost ekspresji genów kodujących fukozylotransferazy oraz neuraminidazę 1 w komórkach larw D. rerio zakażonych TiLV. Znacząco większy poziom ekspresji po zakażeniu TiLV obserwowano również w przypadku genu cmah kodującego hydroksylazę katalizującą syntezę kwasu glikoliloneuraminowego (Neu5Gc). Osobniki dorosłe wykazują spadek ekspresji genów neu4 i st6galnac5a oraz wzrost poziomu neu1 i st3gal4 w pierwszym dniu zakażenia TiLV względem CTR. Ponadto stwierdzono wprost proporcjonalną zależność między ekspresją genów cmah, neu1 i st3gal4 w TiLV-pozytywnych larwach a czasem infekcji.Otrzymane wyniki wskazują, że infekcja wirusa TiLV zmienia poziom ekspresji genów kodujących enzymy zaangażowane w proces glikozylacji w komórkach danio pręgowanego. Wskazanie komórek larw D. rerio, w których dochodzi do zmian glikozylacji oraz określenie znaczenia funkcjonalnego tych zmian wymaga kolejnych badań.
