Prawidłowy wzrost, rozwój i funkcjonowanie pęcherzyków jajnikowych są niezbędne do prawidłowej pracy jajników. Procesem, który zapewnia odpowiednią liczbę komórek jest proliferacja ściśle związana z cyklem komórkowym, odgrywającym istotną rolę w ich podziale. Cykl komórkowy jest wysoce uporządkowaną sekwencją cyklicznie powtarzających się zdarzeń, które prowadzą do podziału komórki i obejmuje zazwyczaj cztery fazy: G1, S, G2 oraz M, a w każdą z faz zaangażowane są cząsteczki regulatorowe w tym, cykliny oraz PCNA (antygen jądrowy komórek proliferujących). Cykliny współdziałają z kinazami powodując ich aktywację. Na ekspresję wyżej wymienionych białek wpływają różne cząsteczki sygnałowe, wśród których można wyróżnić neuropeptydy, a do których należy feniksyna-14 (PNX-14), będąca produktem proteolitycznego rozczepienia małego integralnego białka błonowego 20 (SMIM20) działając w sprzężeniu z receptorem GPR173. Wcześniejsze badania naszego zespołu wykazały wpływ PNX-14 na proliferację komórek ziarnistych (GCs) i cykl komórkowy. Jak dotąd brak jest badań dotyczących wpływu PNX-14 na białka zaangażowane w cykl komórkowy GCs pęcherzyka jajnikowego świni. Dlatego celem niniejszej pracy było określenie wpływu PNX-14 na białka cyklu komórkowego, w tym cykliny A, B, D, E oraz PCNA w pęcherzyku jajnikowym świni. Do badań wykorzystano dojrzałe płciowo samice świń, od których pobrano jajniki w 10-12 dniu cyklu rujowego. Przeprowadzono hodowlę in vitro GCs w medium M199 z dodatkiem PNX-14 w stężeniu 100 nM przez 48 h. Następnie do zbadania ekspresji mRNA wykorzystano metodę RT-qPCR, natomiast w celu określenia ekspresji białka cyklin i PCNA przeprowadzono analizę Western Blot. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą programu GraphPad Prism8 wykorzystując test T-studenta. Uzyskane wyniki wskazują na zwiększoną ekspresję białka w odpowiedzi na działanie PNX-14 dla cyklin A, B, D, E oraz PCNA. Z kolei analiza poziomu transkryptu wykazała, że PNX-14 zwiększa ekspresję mRNA cykliny A i cykliny B, przy jednoczesnym obniżeniu ekspresji mRNA dla cykliny D i PCNA. Nie zaobserwowano natomiast zmian w ekspresji mRNA cykliny E. Podsumowując, powyższe badania wykazały, że PNX-14 stymuluje proliferację GCs świni poprzez wpływ na ekspresję genu i białek kluczowych regulatorów cyklu komórkowego.
Proper growth, development, and functioning of the ovarian follicles are essential for the proper functioning of the ovaries. The process that ensures the appropriate number of cells is proliferation closely related to the cell cycle, which plays an important role in their division. The cell cycle is a highly ordered sequence of cyclically repeating events that lead to cell division and typically includes four phases: G1, S, G2, and M, each phase involving regulatory molecules including cyclins and proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Cyclins interact with kinases causing their activation. The expression of the above-mentioned proteins is influenced by various signaling molecules, among which neuropeptides can be distinguished, including phoenixin-14 (PNX-14), which is a product of proteolytic cleavage of the small integral membrane protein SMIM20 acting in conjunction with the GPR173 receptor. Previous studies by our team have shown the effect of PNX-14 on granule cell (GCs) proliferation and cell cycle. So far, there have been no studies on the effect of PNX-14 on proteins involved in the cell cycle GCs of the porcine ovarian follicle. Therefore, this study aimed to determine the effect of PNX-14 on cell cycle proteins, including cyclins A, B, D, E, and PCNA in the porcine ovarian follicle. Sexually mature female pigs, from which the ovaries were collected on the 10-12 days of the estrous cycle, were used for the study. GCs were cultured in vitro in the M199 medium with the addition of PNX-14 at a concentration of 100 nM for 48 h. Then, the RT-qPCR method was used to examine mRNA expression, and Western Blot analysis was performed to determine the expression of cyclin and PCNA proteins. The obtained results were subjected to statistical analysis using the GraphPad Prism8 program using the student's T-test. The obtained results indicate an increased expression of the protein in response to the action of PNX-14 for cyclins A, B, D, E, and PCNA. In turn, analysis of the transcript level showed that PNX-14 increased the expression of mRNA of cyclin A and cyclin B while reducing mRNA expression of cyclin D and PCNA. However, no changes in cyclin E mRNA expression were observed. In summary, the above studies showed that PNX-14 stimulates the proliferation of porcine GCs by influencing the expression of genes and proteins of the key cell cycle regulators.
